1.配制含10%DMSO或甘油,、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,，去除舊培養(yǎng)液,，用PBS清洗，去除PBS,，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養(yǎng)皿表面）把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái),，離心1000rpm，5min,；

2.去除胰蛋白酶,，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻,，計(jì)數(shù),，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的zui終密度為5×106/ml～1×107/ml，將細(xì)胞分裝入凍存管中,，每管1～1.5 ml,；

3.在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者,，凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/ min,；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min,；到-100℃時(shí),，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ,，然后放入-70℃冰箱中過夜,，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi),。

（二）細(xì)胞復(fù)蘇

1.從液氮容器中取出凍存管,，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化,，從37℃水浴中取出凍存管,，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液,，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液,，混勻；

2.離心， 1000rpm,，5min,；棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,，計(jì)數(shù),，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶,，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),；

3.次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng),。

注意事項(xiàng)

1．從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存,，但為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液,；

2．將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí),，要做好防護(hù)工作，以免凍傷,；

3．凍存和復(fù)蘇用新配制的培養(yǎng)液,。

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