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細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)用試劑
閱讀：1544發(fā)布時(shí)間：2016-1-20
在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶,，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷,、電解質(zhì)升高、滲透壓改變,、脫水,、PH改變,、蛋白變性等,， 能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑,，可使冰點(diǎn)降低,。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞,。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的 形成,。
細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過細(xì)胞zui易受損的－5～0℃,，細(xì)胞仍能生長(zhǎng),，活力受損不大。
目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油,，它們對(duì)細(xì)胞無毒性,，分子量小，溶解度大,，易穿透細(xì)胞,。
二,、操作步驟
（一）凍存
1、消化細(xì)胞（同實(shí)驗(yàn)二）,，將細(xì)胞懸液收集至離心管中,。
2、1000rpm離心10分鐘,，棄上清液,。
3、沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng),，計(jì)數(shù),，調(diào)整至5×106/ml左右。
4,、將懸液分至凍存管中,，每管1 ml。
5,、將凍存管口封嚴(yán),。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴(yán),，否則復(fù)蘇時(shí)易出現(xiàn)爆裂,。
6、貼上標(biāo)簽,，寫明細(xì)胞種類,，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩,。
7,、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時(shí)）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。
注意：操作時(shí)應(yīng)小心,，以免液氮凍傷,。液氮定期檢查，隨時(shí)補(bǔ)充,，不能揮發(fā)干凈,，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
（二）復(fù)蘇
1,、準(zhǔn)備一個(gè)茶缸或1000ml的燒壞,，內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水。
2,、從液氮中取出凍存管,、迅速置于溫水中并不斷攪動(dòng)。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。
3,、打開凍存管,，將細(xì)胞懸液吸到離心管中。
4,、1000rpm離心10分鐘,，棄去上清液。
5,、沉淀加10ml培養(yǎng)液,，吹打均勻，再離心10分鐘,，棄上清液,。
6、加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,，37℃培養(yǎng),，第二天觀察生長(zhǎng)情況。
三,、試劑和器材
器材：液氮罐,、凍存管（塑料螺口凍存管或安瓿瓶）、離心管,、吸管,、離心機(jī)等
試劑：0.25％胰酶、培養(yǎng)基,、含保護(hù)劑的培養(yǎng)基（即凍存液）
附：凍存液配制：
培養(yǎng)基加入甘油或DSMO,，使其終濃度達(dá)5—20%。保護(hù)劑的種類和用量視不同細(xì)胞而不同,。配好后4℃下保存,。
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