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細胞傳代實驗（培養(yǎng)技術）
閱讀：1639發(fā)布時間：2014-3-3
根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3種：懸浮生長細胞傳代,、半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）、貼壁生長細胞傳代,。
實驗方法原理
培養(yǎng)細胞傳代根據(jù)不同細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代,；部分貼壁生長的細胞用直接吹打可傳代,；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后,，再吹打傳代,。
實驗材料
細胞 、試劑,、試劑盒 ,、D-Hanks液 、小牛血清,、 RPMI1640 、雙抗 ,、胰蛋白酶 ,、EDTA 、NHCl ,、NaHCO3
儀器,、耗材
凈化工作臺 、離心機,、 恒溫水浴箱,、 冰箱、 倒置相差顯微鏡,、 培養(yǎng)箱,、 吸管、 玻璃瓶,、 培養(yǎng)瓶,、 廢液缸、 吸頭,、 槍頭 ,、膠塞 ,、離心管 、量加樣槍,、 紅血球計數(shù)板
實驗步驟
1. 貼壁細胞的消化法傳代：
（1）吸除或倒掉瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液,。
（2）D-Hanks液洗2～3次。
（3）向瓶內(nèi)加入適量消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動培養(yǎng)瓶,，使消化液流遍所有細胞表面,。
（4）然后吸掉或倒掉消化液后再加適量新的消化液，輕輕搖動再倒掉大部分消化液,，僅留少許進行消化（也可不采用上述步驟直接加消化液進行消化）,。
（5）消化在37℃或室溫25℃以上環(huán)境下進行。
（6）消化2～5 min 后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進行觀察,，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮,，細胞間隙增大后，應立即終止消化,。
（7）吸除或倒掉消化液,，如用EDTA消化，需加Hanks液數(shù)毫升,，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶把殘留消化液沖掉,。
（8）再加培養(yǎng)液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養(yǎng)液,，終止消化,。
（9）用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,，反復吹打瓶壁細胞,，吹打過程要順序進行。
（10）從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束,，以確保所有底部都被吹到,，使細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔不要用力過猛,。
（11）計數(shù),，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。
2. 懸浮細胞的傳代：懸浮細胞傳代可離心收集細胞后傳代,，或直接傳代,。
離心傳代法：
（1）將細胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到15 ml 離心管內(nèi)。
（2）離心800~1000 rpm,，5 min,。
（3）棄去上清，加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi),，用吸管吹打形成細胞懸液,。
（4）計數(shù),，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。
（5）直接傳代即讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底后,，將上清液吸掉1/2~2/3,，然后用吸管吹打形成細胞懸液后再傳代。
3. 部分貼壁細胞的傳代
（1）部分貼壁不牢的細胞,，如Hela細胞等,，不經(jīng)消化處理直接吹打可使細胞從壁上脫落下來，而進行傳代,。
（2）對絕大部分貼壁生長的細胞,，因直接吹打?qū)毎麚p傷較大，細胞常有較大數(shù)量的丟失,，因而需消化后,，才能吹打傳代。
注意事項
1. 胰蛋白酶要預溫,，溫度37℃左右為宜℃,。
2. 離心轉(zhuǎn)速要合適，轉(zhuǎn)速過低,，不能有效分離細胞,，離心速度過大，時間過長,，會擠壓細胞造成損傷甚至死亡,。
3. 要定時觀察細胞，發(fā)現(xiàn)污染,，應及時處理,。
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