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小鼠胚胎干細胞體外EB分化鑒定
閱讀：1627發(fā)布時間：2014-2-7
實驗概要
本方法主要介紹小鼠胚胎干細胞體外EB分化鑒定流程。
主要試劑
高糖DMEM(Gibco,cat 2800-017粉末）,、DMEM/F12（Gibco,cat 2500-062粉末）,、胎牛血清（FBS）（Gibco,cat 6000044）
非必需氨基酸（NEAA） （Gibco,cat 1140050）、胰酶0.25% (1X) with EDTA 4Na, liquid（Gibco,cat NO：25200072）,、明膠（BD,cat NO：354277）,、青鏈霉素（SP）（Gibco,cat 5140122)、L-谷氨酰胺(Gibco,cat NO：25030081),、血清替代物（Gibco,cat 0829028）
10%FBS培養(yǎng)液(Gibco , cat 0099141）
主要設(shè)備
1,、超凈臺
2、CO2培養(yǎng)箱(Thermo , cat NO.3131)
3,、6cm培養(yǎng)皿(corning , cat NO.430166),、10cm培養(yǎng)皿(corning , cat NO.430167)
4、15ml離心管(corning , cat NO.430791),、50ml離心管(corning , cat NO.430829),、凍存管(corning , cat NO.430659)
5、正置顯微鏡
實驗步驟
①常規(guī)方法消化細胞,，吹打時用粗口滴管,，只吹打成細胞團塊；
②將細胞團塊移至6 cm或10 cm培養(yǎng)皿中,，改用含10%FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)（每個6 cm培養(yǎng)皿加5 ml培養(yǎng)液）,；
③將培養(yǎng)皿放入37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天取出1－2次,，輕輕晃動或用粗口滴管吹打,，使細胞懸浮，各團分開,，并逐日觀察,；
④一般培養(yǎng)第3天細胞團開始分層，外部是一層較大的內(nèi)胚層樣細胞,，內(nèi)部的細胞則小而緊密,，為外胚層樣細胞和干細胞，此為簡單類胚,；再培養(yǎng)5－10天,，分層增多，并出現(xiàn)空腔,，整個胚呈圓泡狀,，此為囊狀胚。
⑤收集囊狀胚,，提取mRNA,，反轉(zhuǎn)錄為cDNA,，然后使用三胚層的引物進行PCR來檢測三胚層的基因的表達情況，從而確定囊狀胚中是否有三胚層的分化,，這樣可以確定細胞是否具有在體外分化為三胚層細胞的能力,。
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