 | 重慶市華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司 |
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ACD RNAscope技術(shù)介紹及應(yīng)用
閱讀：73發(fā)布時間：2025-2-6
RNAscope® 由美國Bio-Techne旗下ACD公司于2012 年推出,，是一項新型的RNA原位雜交技術(shù),。它是基于ACD專·利的雙zz型探針設(shè)計,，寡核苷酸互補(bǔ)配對的信號放大系統(tǒng),，通過酶催化底物，可在顯微鏡下看到熒光或可見光的信號,。不僅實現(xiàn)了單一分子RNA的原位檢測,，還可實現(xiàn)在一張組織切片上標(biāo)記多個不同的RNA分,。根據(jù)試劑盒的不同，分為熒光試劑盒和可見光試劑盒,。該技術(shù)可以應(yīng)用到多種類型的樣本中,，如石蠟包埋樣本，冰凍樣本,，貼壁細(xì)胞,，懸浮細(xì)胞樣本等。
RNAscope®技術(shù)原理
RNAscope® 獨·特的雙Z (ZZ)探針設(shè)計有效的防止了探針的非特異性結(jié)合,，同時降低了背景干擾,。一個標(biāo)準(zhǔn)探針是由20對雙Z探針組成，每個Z靶向探針由三部分組成：Z型探針底部是一個18到25堿基長度的序列能夠互補(bǔ)結(jié)合到目標(biāo)RNA上,。這個序列是基于目標(biāo)序列的不同,，以及獨·特的結(jié)合特征而進(jìn)行的特異性設(shè)計。Z型探針的中部是一個間隔序列,，鏈接了探針的上下兩端,。Z型探針的頂端是一個14堿基長度的尾部序列。因而一對Z形探針對的頂端序列組合成一段28個堿基長度的結(jié)合區(qū)以供信號放大前體序列的結(jié)合,。
RNAscope®技術(shù)的優(yōu)勢
特異性：Z形探針對的設(shè)計屏蔽了背景噪音,。單獨·一個Z形探針對即使結(jié)合上非目標(biāo)序列也無法提供信號放大前體序列結(jié)合所需要的足夠長度，從而防止了對于非特異信號的擴(kuò)增,，保障了特異性,；
靈敏度：每三對Z形探針對就足以實現(xiàn)對一個RNA分子的檢測。在RNA分子出現(xiàn)部分序列不能被有效暴露或者部分降解等情況下,，20對Z形探針對的設(shè)計保障了足夠強(qiáng)勁有效的檢測RNA ,；
提供qPCR無法提供的原位信息、形態(tài)信息,；
單分子量級的可視性與量化分析：此20x20x20x的引物設(shè)計與信號放大原理讓單一RNA分子能夠在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡下以一個點狀信號的方式可視化呈現(xiàn),；
能夠探測到降解的RNA ：得益于其相對短小的目標(biāo)結(jié)合區(qū)域(Z形探針對的底端40到50個堿基長度)，此Z形探針對的設(shè)計為檢測到部分降解的RNA提供了保障,；
同時檢測多個靶點：可見光雙靶點RNA的檢測,、 3個靶點RNA的熒光檢測及RNA和蛋白分子的同步檢測。
RNAscope®操作步驟
Step 1透化：通過RNAscope®預(yù)處理試劑盒處理載玻片上固定好的組織或細(xì)胞,，以暴露目標(biāo)RNA,。
Step 2雜交：RNAscope®針對靶基因設(shè)計的20對Z型目標(biāo)探針與目標(biāo)RNA雜交。
Step 3信號放大：RNAscope®檢測試劑盒通過信號擴(kuò)增序列與顯色標(biāo)記有序互補(bǔ)結(jié)合,，從而擴(kuò)大信號,。
Step 4可視信號形成：在透視光學(xué)顯微鏡或者多光譜成像系統(tǒng)的觀測下，每一個目標(biāo)RNA分子以一個點狀信號的形式呈現(xiàn)。
Step 5量化分析：顯微鏡下,，直接計數(shù)或者使用HALO自動化圖像分析軟件,，對每一個細(xì)胞中的RNA單分子信號進(jìn)行精確定量分析。
RNAscope®結(jié)果分析
顯微鏡觀察結(jié)果并分析
根據(jù)每個細(xì)胞中觀察到的點狀信號評分（定量）,，評分標(biāo)準(zhǔn)如下圖所示：
RNAscope®檢測應(yīng)用
1,、腫瘤相關(guān)靶標(biāo)檢測
由于全基因組基因表達(dá)譜技術(shù)的廣泛使用，RNA生物標(biāo)志物或基因表達(dá)特征已成為一類主要的癌癥生物標(biāo)志物,。目前臨床診斷分析中使用的平臺是實時RT-PCR，這種方法有一個嚴(yán)重的缺點:RNA提取的過程破壞了基因表達(dá)測量的組織背景,，使得不可能將觀察到的信號映射到單個細(xì)胞,。此外，這些檢測容易受到意想不到的細(xì)胞類型(如非癌細(xì)胞)和不想要的組織成分(如纖維化和壞死)的干擾,。相比之下,， RNAscope®允許將分子信息與組織病理學(xué)相結(jié)合，以獲得最佳的臨床解釋,。
RNAscope檢測FFPE腫瘤組織中RNA,。A:原發(fā)腫瘤組織(乳腺、肺和前列腺)的顯色染色(DAB),，與泛素C (UBC)探針或細(xì)菌基因dapB探針雜交作為陰性對照,。細(xì)胞核用蘇木精反染。B: FFPE樣品中低拷貝轉(zhuǎn)錄物的熒光檢測,。乳腺腫瘤組織切片用無探針或Alexa Fluor 488標(biāo)記探針組(綠色)與HPRT1或POLR2A雜交,。細(xì)胞核用DAPI反染(藍(lán)色)。[1]
2,、分泌型蛋白的檢測
一些分泌蛋白,，如生長因子、細(xì)胞因子等,，這些蛋白的IHC檢測可能存在缺乏公·認(rèn)的有效的抗體,，蛋白結(jié)果難以判讀等問題，通過RNAscope檢測其mRNA的表達(dá)可能更易得到有效的檢測結(jié)果,。
3,、點突變、可變剪切的檢測
對于點突變,、可變剪切以及高度同源序列翻譯產(chǎn)物的檢測,，因無法生成有效抗體從而無法在蛋白水平進(jìn)行原位檢測，通過RNAscope來可視化定位是很好的替代方法,。
4,、RNAscope®檢測其他應(yīng)用
腫瘤生物標(biāo)志物、腫瘤微環(huán)境檢測；
免疫與免疫治療,、免疫微環(huán)境檢測,；
神經(jīng)研究領(lǐng)域Marker、GRCR,、神經(jīng)激活與可塑性研究等,；
病毒、病毒與宿主相互作用,，如HPV,、HIV、AAV,、溶瘤病毒等,；
干細(xì)胞標(biāo)記與干細(xì)胞微環(huán)境；
基因治療,、CART安全性評估,、TCR-Tcell等多種細(xì)胞治療；
產(chǎn)品產(chǎn)地： 美國
產(chǎn)品品牌：ACD
產(chǎn)品商標(biāo)： RNAscope
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