間充質(zhì)細胞（MesenchymalStemCells,，簡稱MSC）是一類具有多向分化潛能的干細胞,，廣泛存在于多種組織中，如骨髓,、脂肪,、臍帶、牙髓等,。由于其分化潛能強,、免疫調(diào)節(jié)功能顯著，間充質(zhì)干細胞在組織工程,、再生醫(yī)學(xué),、免疫治療等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

操作細則涉及間充質(zhì)細胞的分離,、培養(yǎng),、鑒定,、擴增及儲存等環(huán)節(jié)。以下是操作過程中常見的步驟和注意事項,。

一,、間充質(zhì)細胞的分離

組織取樣

常見的組織來源包括骨髓、脂肪,、臍帶,、牙髓等。選擇適當(dāng)?shù)慕M織并進行消毒,，避免污染,。

取樣時需注意無菌操作，避免外源性污染,。

組織消化

使用酶（如膠原酶,、胰蛋白酶）對組織進行消化，分解組織基質(zhì),，使細胞能夠脫落,。

消化過程通常控制在37°C下進行,，時間一般為30分鐘至1小時,，具體根據(jù)組織類型和酶的種類來調(diào)整。

必須注意酶的濃度,、消化時間以及溫度,，避免細胞損傷。

細胞收集

消化完成后,，加入培養(yǎng)基停止酶的活性,，經(jīng)過離心收集細胞。

使用細胞篩（一般為70μm篩網(wǎng)）過濾,，去除未完全消化的組織塊,。

細胞洗滌

通過離心洗滌細胞3次，去除血液成分,、死細胞及殘留的酶,。

洗滌后用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基重懸細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度,。

細胞培養(yǎng)

將細胞接種到培養(yǎng)瓶中,，加入含有10%-20%胎牛血清（FBS）和其他生長因子的培養(yǎng)基，培養(yǎng)在37°C,、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中,。

二、間充質(zhì)細胞的培養(yǎng)

培養(yǎng)基選擇

常用的培養(yǎng)基為DMEM（低葡萄糖）或α-MEM等，添加10%-20%FBS和1%青鏈霉素（抗生素）作為標準培養(yǎng)基,。

為提高細胞生長,，可能還需要添加一些特定的生長因子，如表皮生長因子（EGF）,、基本成纖維生長因子（bFGF）等,。

細胞培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度：37°C。

CO?濃度：5%,。

相對濕度：大約95%,。

細胞傳代

間充質(zhì)細胞通常在80%-90%融合時進行傳代。

傳代時,，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細胞,，避免長時間消化。

細胞處理后,，離心收集并重懸,，接種至新的培養(yǎng)瓶中，按照適當(dāng)?shù)募毎芏确峙洹?nbsp;

細胞密度與培養(yǎng)瓶

一般建議的接種密度為5000-10000個細胞/cm²,。

傳代時,，保持細胞在適當(dāng)?shù)慕臃N密度范圍內(nèi)，以免細胞因過度密集而相互抑制生長,。

細胞狀態(tài)監(jiān)控

定期觀察細胞形態(tài),，健康的間充質(zhì)細胞通常呈現(xiàn)梭形或紡錘形。

細胞培養(yǎng)基需定期更換（一般為每2-3天）,，保持細胞生長的最佳環(huán)境。

三,、間充質(zhì)細胞的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定

間充質(zhì)細胞在培養(yǎng)時呈梭形,、長條狀，形成單層,、較為均一的細胞層,。

表面標志物檢測

采用流式細胞儀檢測細胞表面標志物，通過免疫熒光法或抗體染色法檢測MSC的特異性表面標志物,。

常見的標志物：

陽性標志物：CD73,、CD90、CD105,。

陰性標志物：CD34,、CD45、CD14,。

分化潛能檢測

間充質(zhì)細胞具有分化成骨細胞,、軟骨細胞和脂肪細胞的潛能，常通過誘導(dǎo)分化實驗來檢測。

骨分化：通過ALP（堿性磷酸酶）,、鈣鹽沉積染色（如茜素紅染色）檢測,。

軟骨分化：通過突觸蛋白染色、甲硫氨酸染色等方法檢測,。

脂肪分化：使用油紅O染色檢測脂肪小滴,。

基因表達檢測

PCR、RT-PCR等方法檢測MSC相關(guān)基因的表達,，如Osterix,、Runx2、PPAR-γ等基因,。

四,、間充質(zhì)細胞的凍存與復(fù)蘇

凍存

細胞在傳代后需進行凍存時，加入適量的凍存液（通常為10%-20%DMSO）和10%-20%FBS,，混合后將細胞分裝入凍存管,。

凍存時，先在-80°C的冰箱中緩慢降溫,，12小時后轉(zhuǎn)入液氮罐儲存,。

復(fù)蘇

取出凍存管，快速將細胞復(fù)蘇于37°C水浴中,，盡量減少復(fù)蘇時間,。

復(fù)蘇后，立即將細胞接種到含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,，避免細胞受到高濃度DMSO的傷害,。

細胞復(fù)蘇后需要密切觀察，若細胞恢復(fù)良好,，則可以按常規(guī)方式進行培養(yǎng),。

五、常見注意事項

無菌操作：所有操作應(yīng)在無菌條件下進行,，尤其是細胞分離,、培養(yǎng)、傳代等過程,，避免細菌,、真菌等污染。

細胞密度控制：過高或過低的細胞密度都會影響細胞生長,，因此在傳代時需要保持適宜的接種密度,。

細胞監(jiān)測：定期檢查細胞生長狀況，及時更換培養(yǎng)基,，并觀察細胞是否有污染或病變跡象,。

凍存操作謹慎：凍存液濃度不當(dāng)或凍存操作不當(dāng)可能導(dǎo)致細胞死亡,，因此操作時要小心，確保細胞存活率,。

通過以上操作細則,，可以確保間充質(zhì)細胞的高效分離、健康培養(yǎng)和可靠鑒定,，為后續(xù)的研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ),。

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