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人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的傳代及處理方法
閱讀：1215發(fā)布時間：2022-6-6
細(xì)胞特性
1）來源：人肺癌組織
2）形態(tài)：上皮細(xì)胞樣,，貼壁生長
3）含量：>1x106細(xì)胞數(shù)
4）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝
5)用途：僅供科研使用。
二．細(xì)胞的培養(yǎng)：
1)準(zhǔn)備1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基87%
特級胎牛血清10%
GlutaMAX—I谷氨酰胺1%
SodiumPyruvate丙酮酸鈉1%
P/S青霉素-鏈霉素1%
2)培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；二氧化碳，5%,。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%,。
3)凍存液：90%血清,，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
三．細(xì)胞處理：
1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入到含4-6mL*培養(yǎng)基的離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液,，*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度,。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL,，T75瓶2-3mL）,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化,。
3.輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液,，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的*培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力,，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行,。
3）細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。
四,、運輸和保存
干冰運輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞
（1）1mL凍存管包裝干冰運輸,，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈,、凍存管瓶蓋脫落,、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系,。
（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨,，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。
細(xì)胞接收后的處理
1）收到細(xì)胞后,，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損,、有液溢出及細(xì)胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們,。
2）請在4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài),，同時給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,，作為售后時收到時細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù),。
3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況,，有些貼壁細(xì)胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況,。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收,，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的*培養(yǎng)基6-8mL,，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長密度達(dá)70%-80%以上,，可以對細(xì)胞進行傳代處理,。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細(xì)胞需要離心回收,。
4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞,，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代,。
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