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無血清培養(yǎng)基那些你要知道的事
閱讀：1872發(fā)布時間：2021-5-31
無血清培養(yǎng)基和試劑被廣泛的應(yīng)用于培養(yǎng)哺乳動物和無脊椎動物細(xì)胞以制備單克隆抗體,，病毒抗原和重組蛋白等。大多數(shù)的無血清培養(yǎng)基含有向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運離子的鐵轉(zhuǎn)蛋白和調(diào)節(jié)葡萄糖攝取量的胰島素,，以及一些蛋白質(zhì)和清蛋白,，纖維蛋白,，胎球蛋白等,，這些蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮各種不同的功能,，如提供細(xì)胞貼壁所需的基質(zhì)，抗生物反應(yīng)器剪切力,，作為脂質(zhì)和其他生長分化因子的載體等。
那么什么是無血清培養(yǎng)基呢,？無血清培養(yǎng)基是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基,。無血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。 用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時,，多數(shù)呈貼壁生長或兼性貼壁生長;而當(dāng)其在無血清,、無蛋白培養(yǎng)基中生長時，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白,、層粘連蛋白,、膠原、玻表粘連蛋白,，細(xì)胞往往以懸浮形式生長,。
了解到什么是無血清培養(yǎng)基之后，那么我們接著了解一下其主要添加成分：
1.促貼壁物質(zhì):許多細(xì)胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴展因子,，一般為細(xì)胞外基質(zhì),，如纖連蛋白、層粘連蛋白等,。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子,，對許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要作用,。纖連蛋白主要促進(jìn)來自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化,，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞,、粒細(xì)胞,、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞,、CHO細(xì)胞,、成肌細(xì)胞等 。
2.促生長因子及激素:針對不同細(xì)胞添加不同的生長因子,。激素也是刺激細(xì)胞生長,、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞必需的,，如胰島素,。
3.酶抑制劑:培養(yǎng)貼壁生長的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代,，在無血清培養(yǎng)基中要須含酶抑制劑,，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的,。常用的是大豆胰酶;抑制劑,。
4.結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白:常見如鐵轉(zhuǎn)蛋白和牛血清蛋白。牛血清蛋白的添加比較大,，可增加培養(yǎng)基的粘度,，保護(hù)細(xì)胞免受機械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白,。
5.微量元素:硒是最常見的,。
此外，無血清培養(yǎng)基應(yīng)該怎么使用呢,？
血清仍是動物細(xì)胞培養(yǎng)中最基本的的添加物,，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),，待細(xì)胞生長旺盛以后,，再換成無血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個適應(yīng)過程，一般要逐步降低血清濃度,，從10%減少到5%,，3%，1%,，直至無血清培養(yǎng),。在降低過程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細(xì)胞死亡,，存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等,。在實驗后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細(xì)胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的,。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前,，要留有種子細(xì)胞，種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中,，以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化,。
為了使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞:
1.處于對數(shù)生長中期
2.>90% 活細(xì)胞率
3.適應(yīng)時以較高的起始細(xì)胞接種
細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的方法
1.直接適應(yīng)--細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基(SFM)中,。
一些類型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無血清培養(yǎng)基,。對于直接適應(yīng)，接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×10~3.5×10細(xì)胞/ml,。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10~3×10細(xì)胞/ml時,，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到2×10~4×10細(xì)胞/ml時,，細(xì)胞*適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基,。每隔3~5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10~3×10細(xì)胞/ml,，細(xì)胞活率在90%時,，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。
2.連續(xù)適應(yīng)--分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基(SFM)中,，與直接適應(yīng)相比較,，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。
(1)以2倍正常接種密度接種生長活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基:25%SFM 混合培養(yǎng)基中,，傳代培養(yǎng)。
(2)當(dāng)細(xì)胞密度>5×10細(xì)胞/ml時,，以2×10到3×10細(xì)胞/ml細(xì)胞密度,，在有血清培養(yǎng)基:SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
(3)以2×10到3×10細(xì)胞/ml細(xì)胞密度,，25%有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng),。
(4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10到3×10細(xì)胞/ml(接種后4到6天)，在100%SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
(5)每隔3到5天,，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10到3×10細(xì)胞/ml,，細(xì)胞活率在90%時，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng),。
建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物,，直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前,，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代,。
在適應(yīng)過程中，最好不要讓細(xì)胞生長過度,。這將增加選擇亞群的可能性,。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比,，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì),，因而更易于受外界因素的影響。
細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清:許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng),，用包含F(xiàn)BS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1(v∶v)的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量:1∶2,，1∶4,，1∶16和100%替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時,，傳代細(xì)胞2到3次,。
培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清,，生長的延遲可能會發(fā)生,，允許進(jìn)行2到3次的傳代，使生長率恢復(fù)到以前的水平,。
特別需要強調(diào)的是:配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水,，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素,、保護(hù)細(xì)胞的大分子,，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害,。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一,。
最后帶大家了解一下細(xì)胞培養(yǎng)基的優(yōu)缺點。
優(yōu)點：
1.可避免血清批次間的質(zhì)量變動,，提高細(xì)胞培養(yǎng)和實驗結(jié)果的重復(fù)性,。
2.避免血清對細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染,。
3.避免血清組分對實驗研究的影響。
4.有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化,。
5.可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化,。
缺點:
1.細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中易受某些機械因素和化學(xué)因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便,。
2.成本較高,。
3.針對性很強，一種無血清培養(yǎng)基僅適合某一類細(xì)胞的培養(yǎng),。
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