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從FFPE DNA樣本生成高質(zhì)量NGS文庫的簡化解決方案
閱讀：1830發(fā)布時間：2020-11-10
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介紹
通常從人體活檢中采集并保存福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣本,，用于組織學(xué)研究,。福爾馬林固定法通過將核酸和蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)容物交聯(lián)并將樣品包裹在蠟中，使材料可在室溫下保存多年,。世界各地的生物中心和研究人員儲存了數(shù)以百萬計的FFPE樣本,。
隨著文庫準(zhǔn)備和下一代測序技術(shù)的進(jìn)步，這些樣本中保存的核酸現(xiàn)在可以被恢復(fù),，以產(chǎn)生重要的基因組信息,。因此，存檔的FFPE樣品成為了豐富而珍貴的研究材料來源,。越來越多的研究實驗室利用zinq FFPE樣本來分析和了解與疾病相關(guān)的基因和突變多種因素導(dǎo)致了從FFPE分離出的DNA質(zhì)量的變化,，包括保存過程中發(fā)生的核酸化學(xué)變化，保存過程缺乏標(biāo)準(zhǔn)化,，以及存檔樣本的年齡,。從FFPE樣本中分離出的DNA質(zhì)量較低，有望產(chǎn)生低復(fù)雜度的NGS文庫,，因為盡管分離出的DNA有明顯的濃度,，但DNA的“可用”量很低為了創(chuàng)建具有大多樣性的庫，選擇正確的庫準(zhǔn)備方法是至關(guān)重要的,。ThruPLEX technoloqy使用莖環(huán)適配器,，這樣就不需要中間的清理步驟，維持單管工作流程,，并保持庫的復(fù)雜性,。后的擴增利用了所有修復(fù)和連接的分子，結(jié)果在文庫中發(fā)現(xiàn)了大量的*分子(Fiqure 1),。另一個好處是,，創(chuàng)建文庫的時間減少到大約兩小時。ThruPLEX DNA-seq庫也可以很容易地與其他應(yīng)用程序集成,，如目標(biāo)富集,。輸入材料的高度多樣性保證了捕獲將產(chǎn)生文庫的優(yōu)良覆蓋整個基因組的目標(biāo)區(qū)域
Fiqure 1.采用ThruPLEX技術(shù)。這個工作流程使用了一個三步單管反應(yīng),，開始的片段雙鏈DNA,，經(jīng)過一個高效的修復(fù)過程。接下來,，莖環(huán)適配器被鈍端連接到修復(fù)的輸入DNA上,。使用高保真聚合酶對這些分子進(jìn)行擴展和擴增，使其包括條形碼,，從而生成索引化的Illumina NGS庫,。
在本技術(shù)說明中,，我們演示了我們的通用文庫準(zhǔn)備試劑盒——ThruPLEX DNA-seg試劑盒與ffpe衍生的DNA一起使用時的性能和特點,。對于非FFPE樣本,，標(biāo)準(zhǔn)方案建議的輸入范圍為0.05-50 ng，在此,，我們將輸入量增加到100 ng,，以補償FFPE樣本中受損的DNA。我們的結(jié)果表明,，在Ilumina平臺上從ffpe提取的DNA中制備NGS文庫時,，ThruPLEX DNA-seq技術(shù)是一個很好的選擇。與其他庫準(zhǔn)備工具包相比,，它提供了更多樣化的庫,，同時小化了GC偏差。我們進(jìn)一步演示了ThruPLEX DNA-Seq試劑盒如何與Agilent SureSelect富集試劑盒成功集成,，對FFPE樣品進(jìn)行靶向測序,。
結(jié)果
ThruPLEX DNA-seg技術(shù)生產(chǎn)的文庫比NEB Next Ultra或KAPA Hyper試劑盒更具多樣性。平均而言,，ThruPLEX library產(chǎn)生的估算庫大小比NEB Next Ultra大80%,，比KAPA Hyper大240%，表明ThruPLEX library中存在更多的*分子(圖2),。正如預(yù)期的那樣,，ThruPLEX DNA-seq產(chǎn)生的重復(fù)讀取不到2%。與NEBNext Ultra相似,，而KAPA Hyper的重復(fù)reads范圍大(3-6%)(圖2),。對文庫分子插入量的檢查顯示，ThruPLEX DNA-Sea試劑盒產(chǎn)生的插入量為190 bp,。大約相當(dāng)于KAPA Hyper庫,，但比NEBNext Ultra的150-bp插入長約27%(圖2)。在對配對端讀取時,，插入長度越長往往越有利,，因為有更多的不重疊讀取，可以更好地表示原始序列信息,。
圖2. 高度多樣化的庫,。與其他測試試劑盒相比，ThruPLEX DNA-seq文庫提供了更多*的分子(上圖)和更少的重復(fù)(上圖),。下圖:ThruPLEX DNA-seq創(chuàng)建的分子平均插入尺寸比NEB Next Ultra長-27%,。比較了三種試劑盒制備的文庫的GC覆蓋率。ThruPLEX DNA-Seg試劑盒產(chǎn)生了平衡的GC覆蓋率(圖3),。
圖3. 均一的GC的覆蓋度,。由ffpe衍生的DNA制成的DNA序列分析文庫覆蓋了整個人類基因組。然后使用Agilent ClearSeq Human DNA Kinome面板對ThruPLEX DNA-seg文庫進(jìn)行富集,。在每種情況下,，庫的質(zhì)量都很高,，如圖4中的數(shù)據(jù)所示。通過測序深度測量的Kinome覆蓋率與樣本有關(guān),，并在目標(biāo)面板覆蓋40-50X的情況下進(jìn)行測序,。所有樣品上餌覆蓋率均大于70%
圖4. 使用Agilent ClearSeq Human DNA Kinome面板豐富了ThruPLEX DNA-seq文庫的目標(biāo)測序指標(biāo)。
結(jié)論
FFPE樣本的序列可能非常具有挑戰(zhàn)性,。在固定過程中引入的不同程度的化學(xué)損傷減少了可用于構(gòu)建文庫的“優(yōu)質(zhì)”材料的數(shù)量,。為此，在這一系列實驗中,，我們修改了標(biāo)準(zhǔn)的ThruPLEX DNA seq協(xié)議,，將輸入量增加到100ng。這使我們能夠創(chuàng)建更多樣化的庫(庫復(fù)雜性高80-240%),，并且比其他庫準(zhǔn)備試劑盒包含更少的擴增,。
訂購信息：
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 單位 |
R400674 | ThruPLEX® DNA-Seq Kit | 24 |
R400675 | ThruPLEX® DNA-Seq Kit | 48 |
R400676 | ThruPLEX® DNA-Seq Kit | 96 |
R400677 | ThruPLEX® DNA-Seq Kit | 480 |
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