細胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是“慢凍快融”，這樣可以大限度的保存細胞活力,。目前細胞凍存多用二甲基亞砜（DMSO）作為保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性,；緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外,，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少冰晶對細胞的物理損傷,。復(fù)蘇細胞采用快速融化的方法可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)融化,，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。

細胞凍存操作要點：

1,、細胞凍存前12~24h,，換新鮮培養(yǎng)基，使細胞一直處于對數(shù)生長期,。

2,、待細胞長至80%匯合時胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)基吹打后制成細胞懸液,，1000rpm離心10min,。懸浮細胞則直接離心。

3,、棄上清,，加入凍存液重懸細胞沉淀，調(diào)整細胞濃度為3×106~1×107cells/mL,。將細胞懸液分至凍存管內(nèi),，每管1~1.5mL，擰緊蓋子,。在管壁上做好標記,，標明細胞名稱、凍存日期等,。（細胞凍存液配方可為胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=4：5：1或胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=1：8：1或胎牛血清：DMSO=9：1,，可根據(jù)各實驗室實際條件調(diào)整）

4、按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃過夜→液氮保存,。也可使用程序降溫盒更為方便,，細胞凍存管放入程序降溫盒內(nèi)可直接放入-80℃過夜，再轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi),。注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于低刻度線,；凍存5次后異丙醇需要跟換一次,，以免影響凍存效果。

5,、細胞凍存后應(yīng)取出一管復(fù)蘇,，檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內(nèi)長期保存,，為穩(wěn)妥起見可在細胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng),，觀察細胞生長情況，再繼續(xù)凍存,。

細胞復(fù)蘇操作要點：

1,、將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準備一個15mL無菌的離心管,，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基,。

2、將凍存細胞從液氮罐中取出,，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準備一潔凈的燒杯,，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi),，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）,。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內(nèi)*解凍,，使細胞能盡快通過易受損的溫度段（-5~0℃）,。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起污染,。

3,、用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移至準備好的離心管內(nèi),，輕輕吹打液體,，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度,，吹打時避免產(chǎn)生氣泡,。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi),。

4,、800rpm離心5min，棄上清,，加入新鮮的培養(yǎng)基,，吹打制成細胞懸液。

5,、將細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi),，補加適量的培養(yǎng)基,，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng),。

6,、第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞,。繼續(xù)培養(yǎng),，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代,，細胞活力恢復(fù)后才能進行后續(xù)的實驗,。

對DMSO不敏感的細胞在復(fù)蘇時也可不離心，減少操作步驟,，也可降低污染的幾率。將解凍的細胞懸液直接轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi),，補加新鮮培養(yǎng)基,，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。但培養(yǎng)12~20h后必須換新鮮的培養(yǎng)基,，移除死細胞,。

以上信息由企業(yè)自行提供,，信息內(nèi)容的真實性,、準確性和合法性由相關(guān)企業(yè)負責(zé)，化工儀器網(wǎng)對此不承擔(dān)任何保證責(zé)任,。
溫馨提示：為規(guī)避購買風(fēng)險,，建議您在購買產(chǎn)品前務(wù)必確認供應(yīng)商資質(zhì)及產(chǎn)品質(zhì)量。

在線留言

干細胞無血清培養(yǎng)基

干細胞因子及添加物

細胞治療產(chǎn)品

細胞培養(yǎng)耗材

相關(guān)檢測試劑

其他生物試劑

細胞凍存

細胞重編程

蛋白質(zhì)/多肽

抗體/抗原

小型儀器設(shè)備

其他

核酸分析

細胞株

細胞凍存和復(fù)蘇