取人外周血（肝素抗凝）200 ml加入24孔板內(nèi),，加入800 ml的*培養(yǎng)基，再加入1ml PMA(25ug/ml),、1μl Ionomycin（1mg/ml）,，輕輕吹打混勻細(xì)胞。放入 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激0.5小時(shí)后,，每孔再加入2μl Brefeldin A（5mg/ml）,，輕輕吹打混勻細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激3.5小時(shí),。

流式檢測(cè)步驟：

1,、收集細(xì)胞于流式管內(nèi)，500 g/8min離心,，槍頭吸去上清,，彈散管底沉淀，加入相應(yīng)的表面染色抗體（CD3\CD8）,，彈散混勻,。室溫避光孵育15分鐘后，500 g/8min離心,，槍頭吸去上清,；

2、彈散管底沉淀,，加入1ml的固定/破膜工作液,，（1ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3ml Fixation/Permeabilization Diluent稀釋），旋渦混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用,；

3,、室溫避光孵育30分鐘， 600 g/10min離心,，在吸水紙上倒扣流式管棄去上清（此時(shí)細(xì)胞已在管底形成很牢固的沉淀,，不容易丟失），彈散管底沉淀,；

4,、加入1ml Permeabilization Buffer(此為10X,，須與蒸餾水1：10稀釋成工作液)工作液離心洗滌細(xì)胞，破膜15分鐘（室溫避光）,， 600 g/10min,，在吸水紙上倒扣流式管棄去上清，彈散管底沉淀,；

5,、加入100μl Permeabilization Buffer（1x），同時(shí)加入相應(yīng)的細(xì)胞因子染色抗體,，室溫避光孵育15分鐘,；

6、加1ml Permeabilization Buffer（1x）,，600 g/ 8min,；在吸水紙上倒扣流式管棄去上清；彈散管底沉淀,；

7,、加入適量體積（建議300~500 ml）的PBS重懸細(xì)胞，并上機(jī)檢測(cè)并分析,。

注意：1,、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇相應(yīng)的抗體，并做單染管用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償（具體如何設(shè)置單染管,，可參照Biogems流式手冊(cè)補(bǔ)償章節(jié)介紹）,。

2、盡量做同型對(duì)照,，因細(xì)胞因子表達(dá)量不高（尤其是IL-4表達(dá)量非常低）,，細(xì)胞因子抗體對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照一般都要做。

3,、PMA刺激會(huì)導(dǎo)致人T細(xì)胞表面CD4表達(dá)的下調(diào),，PMA與Lonomycin聯(lián)合刺激下調(diào)非常明顯，4h刺激后會(huì)下調(diào)50%以上,，6h刺激幾乎檢測(cè)不到CD4,，因此我們的界定CD4+T細(xì)胞是通過(guò)染CD3和CD8，來(lái)圈CD3+CD8-的細(xì)胞,。

4,、PMA對(duì)小鼠T細(xì)胞CD4表達(dá)影響很小，因此可以直接染CD4來(lái)圈門,。

5,、因破膜劑對(duì)細(xì)胞損傷較大，建議離心后形成的細(xì)胞沉淀先彈散形成細(xì)胞懸液,，在加入破膜劑,，這樣會(huì)減少對(duì)細(xì)胞的損傷（形成的細(xì)胞碎片較少）。

人外周血TH1/TH17染色結(jié)果

注意：細(xì)胞破膜后對(duì)形態(tài)影響較小,，因此可以直接圈淋巴門分析,，在通過(guò)圈CD3+CD8-的細(xì)胞（此處未列出圖）來(lái)分析CD4+的細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的量。因此此圖橫坐標(biāo)就直接標(biāo)的CD4,。

人TH1/TH2/TH17染色所需抗體及輔助試劑

品牌	產(chǎn)品編號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	價(jià)格
BioGems	05111-60	Anti-Human CD3 PE	25 test/100 tests	700元/
BioGems	10111-50	Anti-Human CD8a FITC	25 test/100 tests	560元/
BioGems	80811-80	Anti-Human IFN gamma APC	25 test/100 tests	1680元/
BioGems	81111-77	Anti-Human IL-4 PE-Cy7	25 test/100 tests	1890元
BioGems	73821-60	Anti-Human IL-17A PE	25 test/100 tests	1890元
BioGems	44212-80-100	Mouse IgG1 Isotype Control APC	100 mg	1750元
BioGems	44212-77-100	Mouse IgG1 Isotype Control PE-Cy7	100 mg	1890元
BioGems	44212-60-100	Mouse IgG1 Isotype Control PE	100 mg	1890元
BioGems	2031560-5mg	Brefeldin A	5 mg	880元
BioGems	5608212-1mg	Ionomycin (calcium salt)	1 mg	880元
BioGems	1652981-1mg	Phorbol 12-myristate 13-acetate,，PMA	1 mg	880元
BioGems	92110-00-150	Permeabilization Buffer (10X)	150 ml	1030元
BioGems	92160-00-160	Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent	160 ml	420元
BioGems	92550-00-50	Transcription Factor Fixation/Permeabilizatio Concentrate	50 ml	1050元
			總價(jià)	17390元

方案提供：Biogems*。Biogems是PeproTech的流式抗體品牌,，優(yōu)勢(shì)是基于優(yōu)異品質(zhì)的較低價(jià)位,，現(xiàn)正進(jìn)行一系列*活動(dòng)。

TH1/TH2/TH17流式抗體檢測(cè)配色方案產(chǎn)品由重慶市華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司授權(quán)代理,，：

重慶市華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司 ,，：

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