CD34+造血干細胞是血液系統(tǒng)中的關鍵細胞,，具有自我更新和多向分化潛能,。通過轉染技術，可以研究基因功能并開發(fā)新的治療策略,。ProteanFect Max作為一種高效的轉染試劑,，已被證明能顯著提高mRNA轉染效率，且對細胞分化影響較小,。
2. 材料與方法
2.1 CD34+造血干細胞的分選
使用動員人單采血或臍帶血,，通過陽性選擇分選試劑盒分離CD34+細胞。推薦使用Lymphoprep™（Stemcell, 07861）作為分離試劑,，以及CD34 MicroBead Kit, human（Miltenyi Biotec, 130-046-702）進行細胞分選,。
2.2 培養(yǎng)基的配制
SFEM II培養(yǎng)基（Stemcell, 09655）和StemSpan™ CC100（Stemcell, 02690）以99:1比例混合。
若添加抗生素,，需稀釋1000倍,。
配制完成后，培養(yǎng)基應放置于4°C冰箱儲存，并盡量在1個月內使用完,。
2.3 細胞培養(yǎng)與傳代
分選后的CD34+細胞以300g離心5分鐘,，用1 mL完·全培養(yǎng)基重懸后計數。 根據計數結果,，將細胞重懸至105 cells/mL的密度,，接種到T25培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)板中。
3天后補液一次,，若進行轉染實驗,，需調整細胞密度至2×105 cells/mL，并隔天補液,。
2.4 轉染操作
轉染核酸：mRNA,。
轉染培養(yǎng)基：使用Opti-MEM培養(yǎng)基或無血清RPMI 1640/無血清DMEM培養(yǎng)基。
轉染體系：配置ProteanFect Max轉染體系,，具體protocol需參考私戳獲取,。
細胞準備：確保細胞活率超過90%，避免反復離心,。
轉染過程：孵育時間建議15分鐘,，適當延長可提高轉染率，但可能影響細胞活力,。
效率檢測：使用陽性對照mRNA,，轉染后5-48小時內觀察EGFP表達。細胞活率可通過鏡下觀察,、臺盼藍,、AO/PI染色或流式細胞術檢測。
3. 結果
使用ProteanFect Max轉染的CD34+造血干細胞顯示出高達72.3%的mCherry+表達率,，而未處理組僅為0.25%,。此外，轉染后細胞的分化狀態(tài)未受顯著影響,，CD71+CD235-細胞比例在轉染后第2天和第3天保持穩(wěn)定,。
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