在免疫印跡實驗中遇到的質(zhì)控問題之一最常見的就是高背景,。當(dāng)一個高的背景發(fā)生時,，很難從不相關(guān)的數(shù)據(jù)中區(qū)分出相關(guān)的數(shù)據(jù)。一個常見的高背景可以由于很多原因?qū)е峦瑫r需要一些工作來解決 -- 因為不解決這些問題,，這個印跡無法讀取.
保證緩沖液沒有被污染
一個被污染的緩沖液在免疫印跡中很容易導(dǎo)致高的背景。大多數(shù)情況下,，由于細(xì)菌的存在會導(dǎo)致被污染的緩沖液 -- 但是也有其他的污染物. 當(dāng)污染物進(jìn)入到緩沖液中后,，他們會影響整個印跡的整體, 包括背景. 解決這種干擾的辦法是將舊的緩沖液全部扔掉，重新配置新緩沖液,。
確保操作步驟是*恰當(dāng)?shù)?/span>
另外一個能夠?qū)е赂弑尘暗脑蚴菦]有進(jìn)行恰當(dāng)?shù)牟僮鞑襟E。差的膜操作,，膜過度曝光,， 以及不足的漂洗都會導(dǎo)致高背景,。這些問題可以通過恰當(dāng)操作來解決。當(dāng)膜變干的時候膜的糟糕操作通常會發(fā)生,。如果沒有使用正確的化學(xué)試劑恰當(dāng)?shù)臐櫇衲兏?/span>; 通常來說是甲醇.
膜的過度曝光也是一個問題 -- 但是它很容易解決. 你所要做的是將膜曝光的時間縮短. 同樣的,，不充分的漂洗只是需要將沖洗更加充分*. 漂洗用來去掉過量的抗體. 當(dāng)很多抗體存在印跡上時,，很難將印跡和背景區(qū)分開來。改進(jìn)的漂洗也可以通過使用更好的漂洗溶液來進(jìn)行,。
去除不充分的封閉
沒有正確的封閉, 免疫印跡的結(jié)果無法容易讀取. 不充分的封閉通常發(fā)生因為在孵育過程中的問題. 如果孵育的時間不足夠長,，正確的區(qū)域不能得到封閉. 如果孵育的溫度不正確的話,封閉也不能完成. 也有化學(xué)試劑可以加入到這個過程中來進(jìn)一步提高封閉.
保證封閉劑的兼容性
封閉劑, 如同在印跡實驗中使用的其他產(chǎn)品一樣，需要根據(jù)特定的應(yīng)用進(jìn)行調(diào)整. 使用錯誤的封閉劑很容易導(dǎo)致干擾和很差的難區(qū)分的印跡. 一些封閉劑基于血清蛋白的,，而其他的是基于蛋白的。不同的抗體可以和封閉劑有潛在反應(yīng),，所以有必要找到最合適的封閉劑. 無蛋白的封閉劑是良好封閉劑之一也是最容易的溶液.
降低抗體的濃度
通常高濃度的抗體會導(dǎo)致高的背景. 因為抗體濃度太高了,，整個膜會被抗體所包被. 這會使得出決定性的結(jié)論很難. 當(dāng)提到高濃度的抗體，只有很少一些解決方案可以解決?？贵w可進(jìn)行恰當(dāng)漂洗或更低濃度的抗體可以被使用. 膜或許也需要恰當(dāng)?shù)奶幚?-- 只要沒有過度干掉 -- 它不會吸收很多的抗體溶液.
高背景也會發(fā)生當(dāng)使用的化學(xué)試劑和耗材不合適或質(zhì)量很差. 在免疫印跡中高背景是經(jīng)常顯著發(fā)生的多種問題之一,。.
其他需要考慮的因素之前已經(jīng)討論了就是轉(zhuǎn)印膜的選擇: PVDF膜或硝酸纖維素膜 - 哪種膜最好?. 一個經(jīng)常被忽視的問題是膜的效期. 在使用膜之前, 確保它沒有過期同時被正確儲存,。
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