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介紹PCR儀的兩種定量方法
閱讀：1506 發(fā)布時(shí)間：2022-11-11
將熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中,，通過不斷累積熒光信號從而使對PCR全程的實(shí)時(shí)監(jiān)測實(shí)現(xiàn)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析未知模板的方法,，即是熒光定量PCR技術(shù),。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中,，實(shí)時(shí)檢測全程PCR擴(kuò)增過程,，按照反應(yīng)時(shí)間和熒光信號的變化能夠?qū)⒁粭l曲線繪制成。
定量方法
在實(shí)時(shí)熒光PCR中,，模板的定量包括相對定量和定量2種方法,。相對定量是指在一定樣品中靶序列相對于另一參照序列的量的變化。定量通常根據(jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來使我們所感興趣基因的拷貝數(shù)確定,。
1.相對定量法
相對定量法又分為比較Ct值的相對定量法和比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對定量法兩種方法,。
（1）比較Ct值的相對定量法
該方法是同時(shí)擴(kuò)增待測靶基因片段和內(nèi)參照基因片段,，擴(kuò)增反應(yīng)既能夠在兩個(gè)反應(yīng)管中也能夠在一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行,，并且通過兩者的ct值的差來測量。在采用此方法過程中,，相對量的計(jì)算需要用到數(shù)學(xué)公式,。靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率大體上相同是該方法的前提。因此應(yīng)用過程中效率的偏移會(huì)或多或少影響實(shí)際拷貝數(shù)的估計(jì),。所以,，反應(yīng)體系的優(yōu)化的加強(qiáng)是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相等的保障。
?。?）比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對定量法
相對定量法指的是在一定樣本中,，靶序列相對于另一參照樣本量變化情況進(jìn)行分析的方法，在使用該方法過程中,，參照物必須準(zhǔn)備,，因此定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制比較容易，只要確定了標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度就能夠進(jìn)行對比分析,。
2.定量
定量是通過已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出未知樣本的量的方法,。該方法，需要對標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度情況進(jìn)行明確,，再將標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋,。分為幾個(gè)不同梯度濃度然后進(jìn)行反應(yīng)測試?？v坐標(biāo)為測得的Ct值,，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值，從而將標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制出來,，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線,，在對未知樣品定量分析的過程中樣起始拷貝數(shù)能夠通過ct值被推算出來。