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超微量分光光度計在核酸定量中的應(yīng)用
閱讀：1808 發(fā)布時間：2021-1-22
無論在物理學(xué)、化學(xué),、生物學(xué),、醫(yī)學(xué)、材料學(xué),、環(huán)境科學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域,還是在化工,、醫(yī)藥、環(huán)境檢測,、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門,紫外可見分光光度計督有廣泛而重要的應(yīng)用,。分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器，常用于核酸,，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量,。
超微量分光光度計已成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸,，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量,。
核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率較高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA,。核酸的較高吸收峰的吸收波長260nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig,。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前,，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液,。然而,，實驗并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者頭痛的問題,。靈敏度越高的儀器,，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實上,，分光光度計的設(shè)計原理和工作原理,，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和準(zhǔn)確度,。如德國伯赫Colibri超微量分光光度計的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）,。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的,。另外,，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時,，離子濃度太高,，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定,、離子濃度較低的緩沖液,，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù),。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測試效果,。為了能減少顆粒對測試結(jié)果的影響,，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值在0.1-1.5A,。在此范圍內(nèi),，顆粒的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定,。從而意味著樣品的濃度不能過低,，或者過高（超過光度計的測試范圍）。后是操作因素,，如混合要充分,，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值,；混合液不能存在氣泡,，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈,；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色杯,；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的較小體積等多個操作事項。
除了核酸濃度,，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度,，因為蛋白的吸收峰是280nm,。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8或者2.0,，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物,，多肽，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0,。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,，A320一般是0,?！?/div>