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急性髓系白血病(AML)是成人中最常見的急性白血病,，其特點是骨髓(BM)和外周血中髓系前體的克隆擴(kuò)增。AML的醫(yī)療需求明顯未得到滿足,，高達(dá)50%的患者在初始化療后復(fù)發(fā),，老年患者的預(yù)后仍然很差。

一些靶向免疫療法,，如單克隆抗體,、雙特異性T (TCE)和殺傷細(xì)胞接合分子，以及嵌合抗原受體(CAR-T)細(xì)胞,，目前正在臨床評估中,。它們靶向AML原細(xì)胞上表達(dá)的各種抗原,，其中CD33和CD123抗原是最常見的靶標(biāo),。

CD123是IL-3受體(IL-3Rα)的α鏈，在AML中經(jīng)常高水平表達(dá),，主要表達(dá)于白血病干細(xì)胞或祖細(xì)胞,，與預(yù)后不良相關(guān)。在一些臨床試驗中,，靶向CD123的細(xì)胞毒抗體顯示出有限的抗白血病活性,，即使是經(jīng)過特異性設(shè)計以增加抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。相比之下,，TCE分子和CAR-T細(xì)胞具有一定的臨床療效,，但也具有高毒性，這證實了替代靶向方法的必要性。

在這種情況下,，基于NK細(xì)胞的治療可能為靶向AML細(xì)胞提供新的治療視角和更安全的替代方案,，沒有T細(xì)胞治療常見的并發(fā)癥，如細(xì)胞因子釋放綜合征或神經(jīng)毒性,。由于NK細(xì)胞的wan全激活需要不同激活受體的協(xié)同作用,，作者開發(fā)了一種基于抗體的NK細(xì)胞接合器(NKCE)技術(shù)，用于生成針對癌細(xì)胞上表達(dá)的抗原的三功能分子(NKp46-CD16a-NKCEs),，并在NK細(xì)胞上協(xié)同NKp46和CD16a,，如下圖。NKp46 (NCR1, CD335)是一種在哺乳動物中高度保守的活化細(xì)胞表面糖蛋白,。NKp46在所有NK細(xì)胞,、ILC1和非常小的T細(xì)胞和ILC3亞群上表達(dá)。NKp46信號通過與CD3ζ和FcRγ的關(guān)聯(lián)介導(dǎo)NK細(xì)胞活化,、細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子釋放,。

主要結(jié)果部分：

●在AML細(xì)胞上表達(dá)的CD64抑制抗CD123抗體的ADCC活性，由于CD64可與抗體Fc片段發(fā)生互作

●CD123-NKCE對AML細(xì)胞具有較強的細(xì)胞毒活性

●在體內(nèi)CD123-NKCE控制AML腫瘤生長

●與CD123-TCE相比,，CD123-NKCE介導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞的藥效學(xué)效應(yīng),，細(xì)胞因子釋放可以忽略不計

結(jié)果具體介紹：

1.首先驗證了在AML細(xì)胞上表達(dá)的CD64抑制抗CD123抗體的ADCC活性

作者對來自7組樣本的AML原代細(xì)胞進(jìn)行抗CD123的抗體處理，發(fā)現(xiàn)抗cd123抗體(CD123-IgG1+)介導(dǎo)了來自患者(前3組)約一半樣本的原細(xì)胞的殺傷,，但對來自另一部分（后4組）樣本的細(xì)胞幾乎沒有活性a,。因此將樣本分為兩組:CD123-IgG1+應(yīng)答者和CD123-IgG1+無應(yīng)答者。同時也說明這兩組之間的差異不能簡單地用CD123表達(dá)的差異來解釋,。流式實驗發(fā)現(xiàn)兩組之間的一個顯著差異是,，在CD123-IgG1+應(yīng)答者的AML母細(xì)胞中不存在FcγR表達(dá)，而在CD123-IgG1+無應(yīng)答者的細(xì)胞中存在FcγR表達(dá),，后者的細(xì)胞表達(dá)CD32和/或CD64 b,。進(jìn)一步的實驗及分析發(fā)現(xiàn)CD64在ADCC耐藥中起主導(dǎo)作用，因為CD123-IgG1+殺傷活性只有在缺乏CD64表達(dá)的情況下才能恢復(fù),。這些結(jié)果支持了一種假設(shè),，即高親和力FcγR CD64在靶細(xì)胞表面順式捕獲抗體Fc可能與NK細(xì)胞上與CD16a的反式結(jié)合競爭，從而干擾了ADCC c,。

2. CD123-NKCE對AML細(xì)胞具有較強的細(xì)胞毒活性

與細(xì)胞毒性抗體不同,，NKCE分子參與NKp46可以以不依賴CD16a的方式促進(jìn)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。作者探索了NKCE分子是否僅結(jié)合NKp46或同時結(jié)合NKp46和CD16a,，可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷表達(dá)CD64的AML靶細(xì)胞,。在AML細(xì)胞上生成靶向CD123的NK細(xì)胞接合分子，接合NKp46 (NKp46- fc null-CD123),，或接合NKp46和CD16a (NKp46- fc -CD123: CD123- NKCE) a, b,。正如已經(jīng)描述的其他靶抗原和癌癥一樣,，靶向CD123的雙功能NKp46-NKCE在體外對MOLM-13 AML細(xì)胞系具有很強的抗腫瘤作用b。隨后驗證了CD123-NKCE對NK細(xì)胞具有較強的活化作用,，且無脫靶效應(yīng),。

3. CD123-NKCE調(diào)控AML腫瘤在體內(nèi)的生長

接下來，作者評估了三功能CD123-NKCE在靜脈注射MOLM-13腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的異種彌散性AML腫瘤模型中的體內(nèi)療效a,。在第一天時進(jìn)行腫瘤異種移植,，一天后分別進(jìn)行vehicle, CD123-IgG1+, CD123-NKCE處理，發(fā)現(xiàn)CD123-NKCE小組顯著提升了小鼠存活率b,。通過抗asialogm1抗體處理小鼠NK細(xì)胞(anti-asialoGM1抗體可使NK細(xì)胞耗竭),，在該模型中wan全消除了CD123-NKCE的功效，證實了NK細(xì)胞在體內(nèi)三功能NKCE分子的抗腫瘤活性中的主要作用c, d,。

4. 與CD123-TCE相比,，CD123-NKCE的優(yōu)勢

強細(xì)胞毒性可能與患者的毒性有關(guān)。因此,，作者在體外測量了CD123-NKCE誘導(dǎo)的人外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)的細(xì)胞因子釋放,，并將結(jié)果與靶向相同抗原的CD3 T細(xì)胞接合抗體工具(CD123-TCE)的結(jié)果進(jìn)行了比較。健康供者在CD123-NKCE或CD123-TCE存在下培養(yǎng)PBMC約20 h,，然后對IL-6,、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的分泌進(jìn)行定量,，發(fā)現(xiàn)CD123-NKCE誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放水平比CD123-TCE低得多a,。另CD123在循環(huán)嗜堿性細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)的一個亞群上表達(dá)，鑒于人PBMC中pDCs的豐度較低,，將重點放在嗜堿性細(xì)胞上,，并通過流式細(xì)胞術(shù)在同一實驗中監(jiān)測該細(xì)胞的消耗，CD123-NKCE治療PBMC促進(jìn)了CD123+嗜堿性粒細(xì)胞的劑量依賴性耗竭b,。CD123-NKCE對NK細(xì)胞的激活和募集與CD123+細(xì)胞耗竭的藥效學(xué)效應(yīng)有關(guān),但在高達(dá)10 μg/ml劑量(68 nM)時,，沒有明顯的促炎細(xì)胞因子釋放，這表明NKCE在治療AML方面比TCE具有更好的效果c,。

總之,，作者在此報告了一種新的基于抗體的NK細(xì)胞接合技術(shù)CD123-NKCE的臨床前開發(fā)，該技術(shù)將靶向于惡性細(xì)胞的CD123,，并將CD16a和NKp46協(xié)同作用于NK細(xì)胞,。具有不可替代的優(yōu)勢：

●解決了基于單抗的ADCC抑制；

●通過與NKp46結(jié)合,，CD123-NKCE特異性靶向NK細(xì)胞并增強NK細(xì)胞活性；

●相較于TCE不會引起明顯的促炎因子釋放具有更好的安全性,。

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