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KRAS熱度已經消退了,？NO...據調查，現在除傳統針對KRAS靶點小分子藥物外,，更多玩家嘗試新興療法征服這一“不可成藥"的難題,，如疫苗，TCR-T療法等,。KRAS可以被細胞外信號以及來自細胞器等亞細胞結構的信號所激活,。在正常的生理環(huán)境下，野生型KRAS主要處于不活躍的GDP結合狀態(tài),。信號促使KRAS脫離GDP,，并與GTP結合，將KRAS轉化為激活狀態(tài),。激活的KRAS能夠結合并激活效應蛋白,，如RAF激酶、PI3K和RalGDS,，促進下游級聯的信號通路，如MAPK,、PI3K和Ral-GEFs通路,。這些信號通路通過細胞復制、生長,、分化和促進細胞周期進程,。一個激活的致癌KRAS基因導致一個突變的KRAS蛋白,，由于GTP水解率大大降低，異常長時間保持其活性GTP結合狀態(tài),。當KRAS蛋白被困在“ON"位置時,，下游效應通路也保持活躍，細胞增殖率保持很高,。其他仍然活躍的效應通路包括那些促進腫瘤發(fā)展過程的通路,，如有絲分裂、細胞遷移,、腫瘤侵襲和血管生成,。 一、高通量篩選試劑盒HTRF®技術提供均相,，免洗KRAS結合檢測試劑盒,，通過這些已驗證的試劑盒，可直接用于抑制劑篩選,，無需優(yōu)化,，每個試劑盒配有重組蛋白、檢測試劑和緩沖液,。如下圖所示,，使用抗Tag1-SOS1（供體）和抗Tag2-XL665（受體）檢測Tag1-SOS1與Tag2-KRAS-G12C之間的相互作用。當供體和受體抗體由于SOS1和KRAS-G12C結合而接近時,，供體抗體的激發(fā)觸發(fā)向受體抗體的熒光共振能量轉移（FRET）,，受體抗體在665nm處特異性發(fā)射。這種特異性信號與KRAS-G12C/SOS1相互作用的程度成正比,。因此,，化合物或抗體阻斷KRAS-G12C/SOS1的相互作用會導致HTRF®信號的減少。  
 使用已知抑制劑對試劑盒進行驗證,，均獲得相應較好的IC50并且與已報道文獻結果相一致,。 
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 二、KRAS靶點相關蛋白全部KRAS相關蛋白均已原核表達系統（E.coli）進行表達,。通過HTRF方式驗證其結合活性,。 1、KRAS WTThe KRAS-WT activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS- WT protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.

2.KRAS-G12CThe KRAS-G12C activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G12C protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal. 3.KRAS-G12D The KRAS-G12D activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G12D protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal
4.KRAS-G12RThe KRAS-G12R activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G12R protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.

5.KRAS-G12VThe KRAS- G12V activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS- G12V protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.
6.KRAS-G13CThe KRAS-G13C activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-G13C protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.
7.KRAS Q61HThe KRAS-Q61H activity was assayed with HTRF technology. The reaction was performed by incubating the KRAS-Q61H protein, GTP, cRAF and beads at 25℃ for 60 min, then reading Ratio 665/620nm signal.

8.SOS1 

9.RAF
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*以上KRAS蛋白無GTP bound,，如需GTP bound,，可聯系優(yōu)寧維。上述蛋白,，常規(guī)規(guī)格有：50μg,，100μg和1mg，如需更大規(guī)格，可聯系優(yōu)寧維定制,。 三,、Anti-Tag抗體話說，不想用試劑盒的情況下,，如何建立assay呢,？蛋白已經有了，還差檢測抗體...這不就來了,！Anti-Tag的HTRF熒光抗體,，在實現高通量，操作簡便等其他技術優(yōu)勢的同時,，可以為assay的建立提供最大的靈活性,。無關乎蛋白本身，僅針對標簽如His,，GST,，FLAG等，選擇對應的配對抗體即可實現實驗方法學開發(fā),。比如：參考上述蛋白KRAS G12C（his Tag）和SOS1（GST tag）,，選擇抗體配對有幾種方式可供參考：

 下圖為Anti-GST-Tb SOS1與Anti-his-XL665 KRAS G12C搭配組合展示。 
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 三,、下游磷酸化蛋白檢測Alpha®和HTRF®技術基于細胞水平進行下游KRAS信號通路的研究,，包括MAPK、PI3K和Ral-GEFs通路,。這些細胞信號分析能夠區(qū)分化合物調節(jié)下游KRAS通路的功效,。HTRF®仍然利用夾心法原理，標記的特異性抗體識別磷酸化蛋白和總蛋白從而進行定量檢測,。全過程無需洗滌,，特異性好，靈敏度高,。 

下圖為p-ERK（圖左）和p-NFkB（圖右）磷酸化試劑盒靈敏度與WB對比,，靈敏度高出30倍不等。

與HTRF®技術不同,，Alpha®雖然也是均相檢測檢測技術,，但其基于化學發(fā)光原理，利用兩個微珠進行檢測來實現更低的實驗背景和超高靈敏度,。一個抗體被生物素化并與鏈霉親和素包被的供體微珠結合,，受體微珠則直接與另一個抗體結合?？贵w與磷酸化蛋白（總蛋白）結合使供體和受體微珠靠近,。供體微珠的激發(fā)使得單線態(tài)氧擴散至受體微珠，從而發(fā)射615nm波長的光信號,。Alpha®的檢測信號與樣本中存在的磷酸化蛋白（總蛋白）的數量成正比,。Alpha®原理如下圖。 

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 四,、3D細胞增殖


基于ATP的發(fā)光法測定細胞增殖和細胞毒性的分析原理,。用適當緩沖液直接裂解細胞后，對細胞ATP進行定量,。在裂解細胞釋放的ATP作用下,，ATP與添加的熒光素反應產生光。

ATPlite 3D and ATPlite 1step 3D Assay 操作流程如下：

ATPlite 3D檢測可以允許細胞密度較高情況下進行檢測,，并且比2D檢測效果明顯,。
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四、微孔板耗材1.3D細胞培養(yǎng)板①板底為高度生物相容的,，超低吸附力聚合物包被du有的合成聚合物MPC,，源于細胞膜組分，與極性基團的磷脂（磷脂酰膽堿）具有相同的結構,，提供自然生長環(huán)境,，并消除批間差異。②易形成形態(tài)大小均勻的球體細胞球體高質量形成率,，細胞形態(tài)均已一致,，板材的均勻性高，可隨時聚焦進行圖片拍攝,，提供重復性更高的數據及更高效更高質量的成像,。③無需更換培養(yǎng)基實驗的佳選擇圓底板，性價比高,。
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2. 其他相關培養(yǎng)板,，檢測板

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