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類器官HE染色,、免疫組化、免疫熒光鑒定方法
類器官HE染色,、免疫組化,、免疫熒光鑒定方法
我們辛辛苦苦養(yǎng)好的類器官，該如何做鑒定呢,？通常是HE染色,、免疫組化或免疫熒光。今天小愛帶大家了解一下具體的染色步驟,。
HE染色實驗步驟
一,、類器官收集
1,、 類器官收集（例如24孔板，收集6-8孔類器官,，大約1000-2000個類器官）
移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加 1-2ml 左右，移液搶輕柔吹打基質膠,，收集在 15ml 離心管中,，4℃靜置 10min。300g 4℃ 離心 5min 棄去上清,。
2,、 類器官清洗
加入1ml PBS重懸移入 1.5ml 離心管，300g 4℃ 離心 5min棄去液體,。
二,、類器官固定
1、PFA固定
加入1ml 4%多聚甲醛(abs9179)至EP管,，輕柔吹打混勻,，至于4℃固定1h（最長不超過10h）,。固定結束后,，300g 4℃ 離心 5min 棄去上清。
2,、 類器官清洗
加入1ml PBS重懸移入 1.5ml 離心管,，300g 4℃ 離心 5min棄去液體。
三,、類器官瓊脂糖包埋
1,、稱量0.2至0.4g瓊脂糖，加入至燒杯或者小試劑瓶內,，加入10mL左右PBS,。微波爐高火融化，每隔5s暫停打開,，觀察,，重復數次至瓊脂糖融化全。
2,、待瓊脂糖溶液降溫至50-60℃,，取20-50uL融化瓊脂糖溶液，加入至1.5ml EP管重懸類器官沉淀,，冰上放30min,，待其凝固。
四,、類器官石蠟包埋
1,、脫水：取出已凝固的含有類器官沉淀的瓊脂糖塊,，在梯度乙醇中脫水，70%,、80%,、90%和95%乙醇各1h，100%乙醇30min,，待其凝固,；
2、融蠟：提前4h左右打開烘箱,，65℃溶蠟,；
3、透明：將脫水完成后的瓊脂糖塊轉移至組織包埋盒中（二甲苯處理前需一直浸泡在無水乙醇中）,，將包埋盒轉移至二甲苯中5min處理兩次,；注：因二甲苯有毒性，需在通風良好區(qū)域進行操作,，取出時盡量瀝盡殘留二甲苯,。
4、浸蠟：透明化處理完成后立即轉入已經融化的蠟缸中,，60℃浸蠟2h后,，更換新的蠟缸再次浸蠟2h；
5,、包埋：包埋在冰盒上進行,，將融好的純蠟倒入蠟盒三分之一處，將瓊脂塊放置于中間位置,，然后再滴蠟包埋直到倒?jié)M,。待蠟塊全凝固后，小心脫下模具,。
6,、切片：將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成薄片,，一般是5-8um厚,，并用小鑷子將包含有完整組織的切片置于40°C溫水中。
7,、撈組織：組織受熱展開,，最好是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時,，一般取載玻片的下1/3或者下1/2,，一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的,，每張載玻片上通常撈兩份組織,，做對照使用,，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時候最好方向一致,，以便觀察,，再將撈出來的載玻片置于架子上，放入37°C溫箱中烘干,。
五,、類器官HE染色
1、脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯I 10min,；二甲苯Ⅱ10min,；無水乙醇Ⅰ5min；無水乙醇Ⅱ5min,；95%酒精5min,；90%酒精5min；80%酒精5min,；70%酒精5min,；蒸餾水洗。
2,、蘇木素染細胞核：切片入Harris蘇木素染3-8min,，自來水洗。
3,、伊紅染細胞質：切片入伊紅染液中染色1-3min,，自來水洗。
4,、脫水封片：將切片依次放入95%酒精I 5min ；95%酒精II 5min,；無水乙醇Ⅰ5min ,；無水乙醇Ⅱ5min ；二甲苯Ⅰ5min ,；二甲苯Ⅱ5min中脫水透明,，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片,。
5,、顯微鏡鏡檢，圖像采集分析
六,、類器官鑒定-HE染色結果（以肺癌為例）
免疫組化實驗步驟
將HE染色步驟里脫蠟后的切片進行如下處理：
1. 抗原修復：加入3%H2O2浸泡10min,，從而除去內源性的過氧化氫酶，然后倒掉H2O2,，在清水中洗兩次,，再加入檸檬酸緩沖液,，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可,，冷卻至室溫,，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫,，蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來,。
2. 血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉,，水洗2次,，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次,，擦干組織周圍的PBS液,，馬上加上血清，使一些非特異 性的位點封閉起來,，然后放入37°C溫箱中半小時,。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）。
3. 加一抗：將溫箱中的載玻片取出,，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清,，加一抗，如果做對照實驗,，就在對照的組織上加PBS,。加完一抗后于4°C冰箱中保存過夜。
4. 加二抗：將載玻片從冰箱中取出,，放入PBS中洗3次,，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗,，然后置于37°C溫箱中半小時,。
5. 加SABC: 將片子從溫箱中取出,，放入PBS中洗3次,，每次5min,，擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）,。
6. 加顯色劑：將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑,。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A,，搖勻，然后加1滴顯色劑B,，搖勻,， 再加1滴顯色劑C,，搖勻，A：DAB,， B：H2O2,，C：磷酸緩沖液）
7. 復染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后，浸泡于蘇木精中染色半分鐘,。
8. 脫水：將復染后的片子置于水中沖洗后,，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min,，最后浸泡在二甲苯中,，搬到通風柜中。
9. 封片：用中性樹膠滴在組織旁邊,，再用蓋玻片蓋上,，要先放平一側，然后輕輕放下另一側,，以免產生氣泡,，封好片子后置于通風柜中晾干。
免疫熒光實驗步驟
將免疫組化步驟里一抗孵育后的切片進行如下處理：
1. 加熒光二抗：PBS浸洗3次,，每次3 min,，吸干切片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中37℃孵育1h,，PBS浸洗3次,；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量避光操作,；
2. 復染核：滴加DAPI避光孵育5 min,，對標本進行染核，用PBS清洗4次,，洗去多余的DAPI,；
3. 封片：防熒光淬滅封片劑封片、熒光顯微鏡觀察,。
本期小愛推薦
| 貨號 | 品名 | 規(guī)格 |
| abs44056210 | 瓊脂糖 | 100g |
| abs42155596 | 石蠟 | 500g |
| abs962 | 1×PBS緩沖液 | 500ml/500ml*10 |
| abs9222 | 伊紅染液 | 100ml |
| abs9214 | 蘇木素染液 | 100ml /500ml |
| abs9177 | 中性樹膠 | 100ml/ 100ml×10 |
| abs7119 | 1.5ml離心管（無菌無酶） | 1袋/1箱 |
| abs7118 | 0.5ml離心管（無菌無酶） | 1袋/1箱 |
| abs9444 | Organotial人肝癌類器官培養(yǎng)基試劑盒 | 1kit |
| abs9445 | Organotial人結直腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒 | 1kit |
| abs9443 | Organotial人肺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒 | 1kit |
| abs9449 | Organotial人胃癌類器官培養(yǎng)基試劑盒 | 1kit |
| abs9447 | Organotial人胰腺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒 | 1kit |
| abs9589 | Organotial人鼻咽癌類器官培養(yǎng)基試劑盒 | 1kit |
| abs9446 | Organotial人乳腺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒 | 1kit |
| abs9558 | Organotial人卵巢癌類器官培養(yǎng)基試劑盒 | 1kit |
| abs9590 | Organotial人宮頸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒 | 1kit |
| abs9448 | Organotial人子宮內膜癌類器官培養(yǎng)基試劑盒 | 1kit |
| abs9739 | Organotial人腦膠質瘤類器官培養(yǎng)基試劑盒 | 1kit |
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