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類器官HE染色,、免疫組化,、免疫熒光鑒定方法
我們辛辛苦苦養(yǎng)好的類器官,，該如何做鑒定呢？通常是HE染色,、免疫組化或免疫熒光,。今天小愛帶大家了解一下具體的染色步驟。
HE染色實(shí)驗(yàn)步驟

一,、類器官收集

1,、  類器官收集（例如24孔板，收集6-8孔類器官,，大約1000-2000個(gè)類器官）
移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加 1-2ml 左右，移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠,，收集在 15ml 離心管中,，4℃靜置 10min。300g 4℃ 離心 5min 棄去上清,。

2,、  類器官清洗
加入1ml PBS重懸移入 1.5ml 離心管，300g 4℃ 離心 5min棄去液體,。

二,、類器官固定

1、PFA固定
加入1ml 4%多聚甲醛(abs9179)至EP管,，輕柔吹打混勻,，至于4℃固定1h（最長(zhǎng)不超過10h）。固定結(jié)束后,，300g 4℃ 離心 5min 棄去上清,。

2、  類器官清洗
加入1ml PBS重懸移入 1.5ml 離心管,，300g 4℃ 離心 5min棄去液體,。

三、類器官瓊脂糖包埋

1,、稱量0.2至0.4g瓊脂糖,，加入至燒杯或者小試劑瓶?jī)?nèi)，加入10mL左右PBS,。微波爐高火融化,，每隔5s暫停打開，觀察,，重復(fù)數(shù)次至瓊脂糖融化全,。

2、待瓊脂糖溶液降溫至50-60℃，取20-50uL融化瓊脂糖溶液,，加入至1.5ml EP管重懸類器官沉淀，冰上放30min,，待其凝固,。

四、類器官石蠟包埋

1,、脫水：取出已凝固的含有類器官沉淀的瓊脂糖塊,，在梯度乙醇中脫水，70%,、80%,、90%和95%乙醇各1h，100%乙醇30min,，待其凝固,；

2、融蠟：提前4h左右打開烘箱,，65℃溶蠟,；

3、透明：將脫水完成后的瓊脂糖塊轉(zhuǎn)移至組織包埋盒中（二甲苯處理前需一直浸泡在無水乙醇中）,，將包埋盒轉(zhuǎn)移至二甲苯中5min處理兩次,；注：因二甲苯有毒性，需在通風(fēng)良好區(qū)域進(jìn)行操作,，取出時(shí)盡量瀝盡殘留二甲苯,。

4、浸蠟：透明化處理完成后立即轉(zhuǎn)入已經(jīng)融化的蠟缸中,，60℃浸蠟2h后,，更換新的蠟缸再次浸蠟2h；

5,、包埋：包埋在冰盒上進(jìn)行,，將融好的純蠟倒入蠟盒三分之一處，將瓊脂塊放置于中間位置,，然后再滴蠟包埋直到倒?jié)M,。待蠟塊全凝固后，小心脫下模具,。

6,、切片：將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成薄片,，一般是5-8um厚,，并用小鑷子將包含有完整組織的切片置于40°C溫水中。

7、撈組織：組織受熱展開,，最好是組織不起皺紋,，用載玻片撈組織時(shí)，一般取載玻片的下1/3或者下1/2,，一般每種組織撈5-6張,，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織,，做對(duì)照使用,，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時(shí)候最好方向一致,，以便觀察,，再將撈出來的載玻片置于架子上，放入37°C溫箱中烘干,。

五,、類器官HE染色

1、脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯I 10min,；二甲苯Ⅱ10min,；無水乙醇Ⅰ5min；無水乙醇Ⅱ5min,；95%酒精5min,；90%酒精5min；80%酒精5min,；70%酒精5min,；蒸餾水洗。

2,、蘇木素染細(xì)胞核：切片入Harris蘇木素染3-8min,，自來水洗。

3,、伊紅染細(xì)胞質(zhì)：切片入伊紅染液中染色1-3min,，自來水洗。

4,、脫水封片：將切片依次放入95%酒精I(xiàn) 5min ,；95%酒精I(xiàn)I 5min；無水乙醇Ⅰ5min ,；無水乙醇Ⅱ5min ,；二甲苯Ⅰ5min ；二甲苯Ⅱ5min中脫水透明,，將切片從二甲苯拿出來稍晾干,，中性樹膠封片。

5、顯微鏡鏡檢,，圖像采集分析

六,、類器官鑒定-HE染色結(jié)果（以肺癌為例）

免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟
將HE染色步驟里脫蠟后的切片進(jìn)行如下處理：
1. 抗原修復(fù)：加入3%H2O2浸泡10min，從而除去內(nèi)源性的過氧化氫酶,，然后倒掉H2O2,，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液,，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可,，冷卻至室溫,，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫,，蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來,。
2. 血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉,，水洗2次,，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次,，擦干組織周圍的PBS液,，馬上加上血清，使一些非特異 性的位點(diǎn)封閉起來,，然后放入37°C溫箱中半小時(shí),。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）。
3. 加一抗：將溫箱中的載玻片取出,，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清,，加一抗，如果做對(duì)照實(shí)驗(yàn),，就在對(duì)照的組織上加PBS,。加完一抗后于4°C冰箱中保存過夜。
4. 加二抗：將載玻片從冰箱中取出,，放入PBS中洗3次,，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗,，然后置于37°C溫箱中半小時(shí),。
5. 加SABC: 將片子從溫箱中取出,，放入PBS中洗3次,，每次5min,，擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時(shí)。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
6. 加顯色劑：將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,，每次5min,，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A,，搖勻,，然后加1滴顯色劑B,，搖勻， 再加1滴顯色劑C,，搖勻,，A：DAB,， B：H2O2,，C：磷酸緩沖液）
7. 復(fù)染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后,，浸泡于蘇木精中染色半分鐘,。
8. 脫水：將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后,，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯,。每個(gè)試劑中放置2min,，最后浸泡在二甲苯中,，搬到通風(fēng)柜中,。
9. 封片：用中性樹膠滴在組織旁邊,，再用蓋玻片蓋上,，要先放平一側(cè),，然后輕輕放下另一側(cè),，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干,。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟
將免疫組化步驟里一抗孵育后的切片進(jìn)行如下處理：
1. 加熒光二抗：PBS浸洗3次,，每次3 min,，吸干切片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,，濕盒中37℃孵育1h，PBS浸洗3次,；注意：從加熒光二抗起,，后面所有操作步驟都盡量避光操作；
2. 復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5 min,，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核,，用PBS清洗4次,，洗去多余的DAPI,；
3. 封片：防熒光淬滅封片劑封片、熒光顯微鏡觀察,。

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