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人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)攻略-原代培養(yǎng)
一、準備工作
1.儀器設(shè)備
CO2 培養(yǎng)箱,、雙人單面超凈臺,、倒置顯微鏡、臺式冷凍離心機,、水浴鍋（abs72023）或水浴搖床,，醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱,、移液器（一套）,、眼科剪、眼科鑷,。
2.試劑耗材
人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒（abs9445）,，基質(zhì)膠（低因子、無酚紅）（abs9495）,，60mm細胞培養(yǎng)皿（abs7005）,， 100μm濾篩（abs7009），15ml離心管（abs7102）,，1.5ml EP管若干（abs7119）,，24孔細胞培養(yǎng)板（abs7058）、金屬冰盒,、眼科剪刀,、眼科鑷。
人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒（abs9445）
試劑盒組成
| 組分名稱 | 規(guī)格 |
| 人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基 A | 100ml |
| 原代培養(yǎng)緩沖液 B | 250ml |
| 人結(jié)直腸癌原代組織消化液 C | 30ml |
| 類器官傳代消化液 D | 30ml |
| 組織保存液 E | 100ml |
| 類器官凍存液 F | 20ml |
| 類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G | 250ml |
基質(zhì)膠（低因子,、無酚紅）（abs9495）
二,、操作流程
1. 類器官操作流程之——樣本準備
（1）將組織放入含有預冷的（2-8°C）組織保存液 E的取樣瓶中（浸沒整個組織），4℃從醫(yī)院/實驗室取回,。
（2）將取樣瓶消毒,，組織取出放入培養(yǎng)皿樣本拍照，并登記,，大小,，顏色,，軟硬程度，組織類型等信息,。
2. 類器官操作流程之——清洗-剪碎
在60mm細胞培養(yǎng)皿（abs7005）里用2-3ml原代培養(yǎng)緩沖液 B浸泡。用原代培養(yǎng)緩沖液 B清洗三次（每次更換培養(yǎng)皿）后剪碎,，剪成大約1-3mm3的組織塊,，靜置2次。
3. 類器官操作流程之——消化-過濾
（1）向EP管中加入適量人結(jié)直腸癌原代組織消化液 C（消化液是組織體積的3-5倍）在37℃進行消化10-15min（消化過程中隨時觀察消化情況）,。
（2）取少量液體在顯微鏡下觀察,，鏡下觀察到較多的單個細胞或 70um 以下的細胞簇后， 加入3倍體積原代培養(yǎng)緩沖液 B 終止消化,，用槍頭輕柔吹打可以看到液體變渾濁,。
（3）使用100μm濾篩（abs7009）進行過濾，取少量濾液在鏡下進行觀察,。將濾液收集到15ml離心管,，于300g 4℃ 富集離心5min后移去上清（清洗一次），添加1ml左右原代培養(yǎng)緩沖液 B 轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管,，重新重懸離心（清洗二次）,。
4. 類器官操作流程之—離心、加膠
基質(zhì)膠計算：第3步后觀察收集到的組織體積,，添加25倍組織體積的基質(zhì)膠（abs9495）重懸鋪板（金屬冰盒或冰上操作）,。
5. 類器官操作流程之——點膠-加液
以24孔細胞培養(yǎng)板為例，每孔點膠25ul組織基質(zhì)膠混合物進行鋪板（（金屬冰盒或冰上操作）,，將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠,，添加500-750μl 人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基 A（恢復室溫）進行培養(yǎng)。
6. 類器官操作流程之——觀察
類器官原代培養(yǎng)D1 類器官原代污染
傳代培養(yǎng)
一,、類器官傳代培養(yǎng)之-樣本收集
1. 移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加 1-2ml 左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G放置 2min。
2．移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠,，收集在 15ml 離心管中,，4℃靜置 10min(每 6-8 孔為一組) 。
二,、 類器官傳代培養(yǎng)之-樣本消化
1. 類器官數(shù)量不足或體積較小時：300g 4℃ 離心 5min 棄去上清,，添加1ml類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸移入 1.5ml 離心管，300g 4℃ 離心 5min（如圖5）棄去液體進行第3步,。
2. 類器官數(shù)量較多或體積較大時：300g 4℃ 離心 5min 棄去上清,，添加適量類器官傳代消化液 D（是類器官懸液的1-2倍）超凈臺內(nèi)消化 2-3min（中間可以吹打1-2次）（如圖6） ，添加適量類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G（緩沖液G：傳代消化液D=5:1）終止消化,，300g 4℃ 離心 5min 棄去上清,，添加1ml類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸移入 1.5ml（ 如圖7） 離心管,，300g 4℃ 離心 5min 棄去液體進行第3步。（如圖4）
三,、類器官傳代培養(yǎng)之-鋪板
類器官收集后,，添加25倍基質(zhì)膠重懸（基質(zhì)膠體積：細胞沉淀體積=25:1），每孔25μl（如圖8） 基質(zhì)膠鋪在 24孔細胞培養(yǎng)板中,，放置培養(yǎng)箱中 10-15min 添加 500μl-750ul（如圖9）人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基 A,。
四、類器官傳代后增殖現(xiàn)象
類器官凍存
1,、移液器吸去培養(yǎng)基,，每孔添加 1-2ml 左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G放置 2min。
2,、移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠,，收集在 15ml 離心管中，4℃靜置 10min(每 6-8 孔為一組) ,。
3. 300g 4℃ 離心 5min 棄去上清,，添加1ml類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸移入 1.5ml 離心管，300g 4℃ 離心 5min棄去液體,。
4,、添加適量類器官凍存液 F，輕柔吹打重懸,，以24孔細胞培養(yǎng)板為例：密度為2個孔凍存 1管（500個/ml密度凍存）,，每管體積1.4ml。
5,、凍存方法（1）：將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜,，第二天取出放入液氮罐。
凍存方法（2）：4℃冰箱放置30 min,，轉(zhuǎn)移至-20℃放置1 h,，最移至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐,。
類器官復蘇
1,、實驗前準備
將水浴鍋預熱至37℃；
細胞實驗室進行常規(guī)消毒,，用預防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面,；
在超凈工作臺中按次序擺好消過毒的離心管、吸管,、培養(yǎng)板等,。
培養(yǎng)箱除菌劑 細胞房除菌劑
2、取出凍存管
根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號,。
從液氮罐中取出凍存盒,，取出所需的凍存管,，同時核對凍存管外的編號。
凍存管（abs7163）
凍存管（abs72023）
3,、迅速解凍
迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中解凍,，并要不斷地搖動，使管中地液體迅速融化,。約1-2min后凍存管內(nèi)液體全溶解,，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺內(nèi),。
4、將類器官組織液移入15ml離心管,，添加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G 10ml重懸,，輕柔吹打混勻，300g 4℃ 離心 5min,。
5,、棄上清，添加1ml 類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸將沉淀轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管,，300g 4℃ 離心 5min,，棄去上清。
6,、添加25倍基質(zhì)膠（abs9495）重懸（基質(zhì)膠體積：細胞沉淀體積=25:1）,，每孔25μl基質(zhì)膠鋪在 24孔細胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中 10-15min 添加 500μl-750ul 人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基 A,。
類器官鑒定
一,、類器官鑒定-類器官收集
1、類器官收集
2,、清洗1-3遍,，洗去大部分基質(zhì)膠，離心棄去大部分上清
二,、類器官鑒定-瓊脂糖凹槽制備
三,、類器官鑒定-固定
四、類器官鑒定-包埋
五,、類器官鑒定-HE染色
六,、類器官鑒定-HE染色結(jié)果（以肺癌為例） 
人肺癌類器官HE染色
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