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最近,，總有小伙伴們前來詢問在做完電轉實驗后,，發(fā)現轉染效率太低了該怎么辦,，于是小優(yōu)通過搜集多方資料、詢問技術專家,，為大家找來了一些解決方案，下面我們就來一起看看吧～

一,、什么是電轉,？

俗話說得好，知己知彼,，方能百戰(zhàn)百勝,，所以首先我們需要清楚電轉的原理。電轉,，也稱電穿孔法,，是通過脈沖電流在細胞膜上打孔，將外源分子（DNA,、RNA ,、mRNA等）導入真核細胞內，來改變細胞的特性,，從而達到改造細胞的目的,，是實現細胞基因功能和蛋白質表達研究的重要工具。與其他細胞轉染技術相比,，電轉具有操作簡便,、適用多種細胞,、重復性好和轉染效率高等優(yōu)點。

二,、影響電轉效率的因素有哪些呢,？

影響電轉效率的因素有很多，總結下來有三方面：電轉過程,、細胞狀態(tài)以及轉染底物狀態(tài),。只有了解影響電轉效率的因素有哪些，我們才能夠“對癥下藥",。

1.電轉過程

1）電轉的完整操作步驟包括電轉前操作,，電轉執(zhí)行和電轉后培養(yǎng)。在進行電轉前操作時,，電轉試劑,、細胞與轉染底物要進行混勻，如果混勻時過于激烈,，會破壞轉染復合物的形成,，從而導致轉染效率降低；

2）在進行電轉前操作時,，電擊緩沖液的選擇也很重要,，由于細胞對緩沖液的離子組成和滲透壓非常敏感，因此組分與細胞質類似的緩沖液有利于細胞電擊后的存活,；

3）電轉執(zhí)行時,，需要控制電場強度和脈沖時間。適當提高電場強度或延長脈沖時間,，能使底物更容易進入細胞,，但細胞的死亡率也會增加。一般電場強度設置遵循低電場長時程的原則,。如果選擇內置優(yōu)化程序的電轉系統,，如Lonza的Nucleofector系統，則可以節(jié)省摸索電場強度和脈沖時間的步驟,。

4）轉染培養(yǎng)基中含有抗生素會影響細胞轉染效率,，這是因為轉染試劑對細胞有損傷，這時培養(yǎng)基中的抗生素會進一步損傷細胞,，因此我們建議使用不含抗生素的培養(yǎng)基或PBS,；

5）電轉后培養(yǎng)要注意，如果使用傳統轉染試劑,，轉染后4-6h后必須進行換液,，否則會由于轉染試劑毒性而引起細胞死亡，最終影響轉染效率,。

2.細胞狀態(tài)

1）細胞污染對細胞狀態(tài)的影響很大,，受到細菌,、真菌或支原體污染的細胞都會導致轉染效率降低、細胞死亡率增加,，尤其是支原體污染悄無聲息,，因此一定要做好定期的支原體檢測，確保細胞狀態(tài),；

2）細胞培養(yǎng)到不同密度都能用于電轉,，但好的轉化效率是在細胞的對數生長期（15代以內，傳代后2d）,。當細胞處于對數生長期時,，有絲分裂較旺盛，表面結構密度比穩(wěn)定期的細胞差,，電轉后,，細胞膜的恢復能力強，而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA,。

3.轉染底物狀態(tài)

1）不同的轉染底物對轉染效率都會產生不同的影響,，例如質粒DNA在大小、用量以及構象這三方面都影響著電轉效率,，IRES導致轉染效率低,，轉染mRNA需要調整洗滌次數等等；

2）轉染試劑與底物的配比,，也會影響轉染效率,，因此需要根據說明書或參考文獻來進行配比優(yōu)化實驗，選用最佳配比濃度,；

3）底物的內毒素,，也會影響轉染效率，內毒素含量過高,，會導致轉染過程中細胞狀態(tài)變差，從而增加細胞死亡率,，降低轉染效率,，因此要對內毒素進行控制。

三,、如何提高電轉效率,？

我們都知道，電轉的操作是需要借助儀器來完成的,，因此除了要考慮上面的這些因素外,，更重要的是選擇一個高效的電轉儀。Nucleofector™技術是Lonza公司的zhuan利創(chuàng)新技術,，利用電擊在細胞膜上開個小孔,，綜合各種特定細胞轉染程序與轉染液的作用,，核酸底物不僅可以進入細胞質，還可直接通過核膜進入細胞核,。相較于傳統電轉技術,，Nucleofector™技術的細胞轉染率可達99%，且實現轉染不依賴于細胞的分裂,。

01 Nucleofector™技術核心：核電轉

利用特定的轉染試劑和細胞保護劑,，通過細微差別的電脈沖，使得轉染物質不僅可以直接進入細胞質,，而且可以直接通過核膜進入到細胞核,。

注：圖片來自Lonza

02 Nucleofector™技術組成

1）Nucleofector™設備：內置針對每種細胞優(yōu)化好的轉染參數。

2）配套試劑盒：試劑盒是包含有轉染試劑,，細胞保護劑,，專用電極杯，吸管,、pmaxGFP™陽性質粒,。

3）數據庫與操作手冊：幾百種細胞的詳細的優(yōu)化方案，不僅有轉染步驟,，也包含了核轉染前后細胞的處理,，如細胞來源、傳代,、生長條件,、培養(yǎng)基以及轉染后培養(yǎng)等細節(jié)技巧。

03 提高電轉效率的方法

1.細胞收集時：

1)在消化貼壁細胞時,，一定要注意終止胰酶反應,，防止過度消化；最好使用專業(yè)的胰酶中和劑,；

2)在進行細胞離心時,，使用低轉速長時間離心，提升細胞的存活率,；

3)選擇合適狀態(tài)的細胞,，一般原代細胞可以傳1-2次后使用；盡量挑選迭代次數少的細胞,，如果是凍存細胞,，建議復蘇1-2h后使用；

4)選擇對數增長期的細胞,；

5)做好支原體清除,。

2.試劑添加：

1）電轉試劑的添加只需室溫操作即可；

2）細胞在試劑中停留不超20min，混合好盡快開始實驗,；

3）轉染的底物占比不能大于總體積的10%,，比如轉染體系100ul，底物最多添加10ul,；

4）在消化的細胞進行配置時,，一定要離心并wan全去除殘留培養(yǎng)基；

5）在加入到電極杯中時,，要避免產生氣泡,，從而影響電脈沖；

6）對底物進行內毒素控制,；

7）轉染試劑與底物濃度配比控制,；

8）如果是mRNA轉染，可多洗滌2次,。

3.程序設置：

1）使用Lonza電轉儀,，程序已經設定好，可以根據不同的細胞名稱,，選擇對應的優(yōu)程序,； 根據實際情況，可以對程序進行微調,，確保轉染效率和細胞存活率,。

2）使用需要自行設置的儀器，一般電場強度設置遵循低電場,、長時程的原則,。

4.細胞重懸：

1）轉染結束之后，可以先停留10min再加培養(yǎng)基重懸,；

2）使用無鈣培養(yǎng)基重懸,，5-10min后轉移細胞到培養(yǎng)皿上；

3）后續(xù)的實驗一般在轉染后24h再進行,；

4）電轉后的細胞,，鋪板數量翻一倍。

5.轉染后細胞的培養(yǎng)：選擇表達高峰期細胞做實驗,，推薦文獻可在Lonza查詢,。