您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)·基礎(chǔ)篇
What is Co-IP？
Co-IP全稱Co-Immunoprecipitation,，中文學(xué)名免疫共沉淀,，是一種以抗體和抗原識別專一性為基礎(chǔ)，用于研究蛋白質(zhì)之間相互作用的經(jīng)典方法,。
通俗點(diǎn)來說,，假設(shè)我們需要研究樣品中A蛋白和B蛋白之間是否存在一些相互作用，首先我們通過合適的方法處理樣本,，將蛋白提取出來（同時(shí)不能破壞蛋白之間的相互作用）,，然后用預(yù)先結(jié)合了瓊脂糖珠或者磁珠的A蛋白抗體捕獲樣本中的A蛋白，那么與A蛋白結(jié)合的B蛋白也能一起沉淀下來,。再將蛋白從珠子上裂解下來,，對B蛋白進(jìn)行檢測，能檢測到,，說明B蛋白在之前的沉淀過程中隨著A蛋白一起被拉下來了,，進(jìn)而證明二者之間存在相互關(guān)系。
How to do,？
實(shí)驗(yàn)流程
A few tips：
如何理解文獻(xiàn)中的結(jié)果,？
各名稱解析：
IB：全稱immunoblotting，即免疫印跡,，也就是常規(guī)的Western Blotting,，用于顯示目的蛋白。
IP：全稱immunoprecipitation,，即免疫沉淀,，這一步主要是為了純化富集目的蛋白。
Input：全細(xì)胞裂解液,，含有細(xì)胞內(nèi)所有的蛋白,，可認(rèn)為是陽性組。也就是處理完樣本得到的細(xì)胞裂解液,，在做IP實(shí)驗(yàn)之前,，需要先跑WB,，確認(rèn)樣本中含有蛋白A和蛋白B。
Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗體
IgG：Anti-A的同型對照抗體,，即跟Anti-A同來源同種型,，如Anti-A是兔來源IgG型，則同型對照抗體需要選擇Rabbit IgG（abs20035）
結(jié)果圖解析：
該結(jié)果是為驗(yàn)證蛋白A與蛋白B是否存在相互作用,。本實(shí)驗(yàn)一共分為兩大組：Input組及IP組,，其中IP組又分為IgG組（陰性對照組）和實(shí)驗(yàn)組，并通過WB去驗(yàn)證蛋白A和B在每一個(gè)組里面是否存在,。由Input組的條帶可以得到結(jié)論：蛋白A與蛋白B都是存在的,，證明樣本處理提取蛋白的步驟沒有任何問題。陰性對照IgG組和實(shí)驗(yàn)組平行進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn),，結(jié)果蛋白A與蛋白B均沒有條帶,，說明利用IgG抗體沒有把蛋白A和B沉淀下來，證明蛋白A和B與IgG沒有結(jié)合,，排除了蛋白與抗體非特異性結(jié)合的可能性,；而實(shí)驗(yàn)組蛋白A和B均有條帶，表示利用蛋白A的抗體進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn),，成功把蛋白A沉淀下來了，與此同時(shí)蛋白B也被沉淀下來,，進(jìn)而得到結(jié)論：蛋白A與蛋白B之間存在相互作用,。
試劑盒寫著50T，意思是能做50次Co-IP實(shí)驗(yàn),？
確切來說,，試劑盒的50T代表著能夠完成50次免疫沉淀反應(yīng)，而實(shí)際上免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置多個(gè)組別進(jìn)行對照驗(yàn)證,，因此具體能夠完成多少次Co-IP實(shí)驗(yàn)由設(shè)計(jì)方案決定,，一般至少需要設(shè)置陰性對照、陽性對照,、實(shí)驗(yàn)組三個(gè)組別,。
預(yù)清除步驟的作用是什么？必須要進(jìn)行嗎,？
這個(gè)步驟的目的是為去除樣本中可與protein A/G瓊脂糖珠非特異結(jié)合的蛋白質(zhì),，減少干擾，非必做,，如CoIP實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有較多雜帶,，可考慮做一下；但應(yīng)注意,，選擇此步驟后,，需要消耗瓊脂糖珠,，后續(xù)能夠進(jìn)行免疫沉淀的次數(shù)也相應(yīng)減少。
陰性對照IgG組出現(xiàn)條帶是什么原因,？
首先需要排除lgG和后續(xù)WB一抗同源導(dǎo)致的輕重鏈的干擾條帶（25kd和50kd附近）,；再者建議進(jìn)行預(yù)清除實(shí)驗(yàn)以排除Protein A/G的非特異性結(jié)合；再就是考慮lgG的問題可以換用其他品牌lgG嘗試,。
出現(xiàn)假陽性結(jié)果該怎么排除,？
假陽性結(jié)果需要設(shè)置對應(yīng)的陰性對照組一一排除，假設(shè)實(shí)驗(yàn)組為瓊脂糖珠+抗體X+靶蛋白X+抗體Y+目的蛋白Y：
| 可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果的成因 | 對照組設(shè)置 |
| 瓊脂糖珠與X蛋白發(fā)生非特異結(jié)合 | 瓊脂糖珠+抗體X+抗體Y |
| 瓊脂糖珠與Y蛋白發(fā)生非特異結(jié)合 | 瓊脂糖珠+蛋白Y |
| 抗體X和目的蛋白Y非特異性結(jié)合 | 瓊脂糖珠+抗體X+蛋白Y |
| 抗體的非特異性結(jié)合 | IgG+蛋白X+蛋白Y |
最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是陰性的,，是否能說明兩個(gè)蛋白之間無相互作用,？
對于內(nèi)源性Co-IP實(shí)驗(yàn)，陰性結(jié)果不能說明無相互作用,，也有可能是蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)過低導(dǎo)致,，因此建議先做過表達(dá)Co-IP作為對照。
IP&WB全套試劑清單推薦
| 貨號 | 品名 | 規(guī)格 | 貨期 |
| abs955 | 免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒 | 50tests | 現(xiàn)貨 |
| abs9146 | PMSF | 5g/25g/100g | 現(xiàn)貨 |
| abs9116 | Lysis Buffer for WB/IP Assays | 100ml | 現(xiàn)貨 |
| abs9239 | Lysis Buffer for WB/IP Assays (Without Enzyme Inhibitors) | 100ml | 現(xiàn)貨 |
| abs20035 | Rabbit IgG | 10mg | 現(xiàn)貨 |
| abs20038 | Mouse IgG | 1mg | 現(xiàn)貨 |
| abs9232 | BCA蛋白定量試劑盒 | 500次 | 現(xiàn)貨 |
| abs9389 | BIS-Tris Gels 預(yù)制膠10%, 10 wells | 10片/盒 | 現(xiàn)貨 |
| abs924 | 預(yù)染蛋白marker, 10-180kDa | 2*250ul | 現(xiàn)貨 |
| abs950 | 10*電轉(zhuǎn)液 | 1L | 現(xiàn)貨 |
| abs954 | WB專用一抗二抗稀釋液 | 100ml | 現(xiàn)貨 |
| abs961 | 10×PBS緩沖液 | 500ml | 現(xiàn)貨 |
| abs952 | 10*TBST | 1L | 現(xiàn)貨 |
| abs9157 | 牛血清白蛋白 (BSA) | 100g | 現(xiàn)貨 |
| abs920 | ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒 | 2*25ml | 現(xiàn)貨 |
| More....... | |||
上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司
試劑 | 耗材 | 儀器 | 軟件 | 定制 | 實(shí)驗(yàn)服務(wù) | 供應(yīng)鏈
微信公眾平臺：優(yōu)寧維抗體專家,，歡迎關(guān)注,！
小優(yōu)博士（小程序）：5大課堂, 讓你的科研不再難！
