何謂常規(guī)反相色譜柱,？

  在硅膠或雜化基質(zhì)顆粒上鍵合了如C₁₈、C₈,、C₄或苯基等鍵合相的色譜填料所裝填的色譜柱,，按反相色譜條件進(jìn)行操作和分離。反相是液相色譜中常使用的分離模式,，而C₁₈柱是常使用的反相色譜柱之一,。

新色譜柱開啟和安裝的推薦步驟：

1. 使用新鮮潔凈的水與乙腈。沖洗系統(tǒng),，確保系統(tǒng)干凈,，不含任何緩沖鹽和污染物。

2. 取用色譜柱時避免磕碰掉落,。

3. 將色譜柱入口端連接到系統(tǒng)上,，柱出口端先不要連接，色譜柱身上有箭頭標(biāo)明正確流向,。

4. 在0.1 mL/min流速條件下用純乙腈潤洗色譜柱,，然后在2分鐘內(nèi)將流速升至0.5 mL/min。

5. 當(dāng)溶劑均勻的從柱出口端流出,，停流速,，將色譜柱出口端接到系統(tǒng)檢測器上（這樣可以避免氣泡進(jìn)入檢測系統(tǒng)，并且可快速達(dá)到基線平衡）,。

6. 重啟流速,，按照步驟4的方法逐漸提高流速，至常規(guī)分析時所使用的流速,。

7. 參考柱效測試報告中的方法,，使用該流動相條件平衡色譜柱，通常需要使用5-10倍柱體積的流動相,，直至壓力與基線穩(wěn)定,。

8. 測試柱效。如果沒有柱效測試報告中的分析物,，請聯(lián)系沃特世化學(xué)消耗品部門尋求支持,，使用合適的濃度與進(jìn)樣量。柱效結(jié)果略低于柱效測試報告屬正常情況,。如結(jié)果明顯偏低,、峰形拖尾,，提示色譜柱和/或所使用的液相系統(tǒng)處于非理想狀態(tài)，需要進(jìn)行故障排查,。

當(dāng)使用2.1 mm內(nèi)徑色譜柱時,，建議優(yōu)化系統(tǒng)以減少譜帶展寬，包括：使用檢測器微量流通池,，減少進(jìn)樣器loop環(huán)體積,，使用較小內(nèi)徑（如0.005''或0.12 mm）的系統(tǒng)管路。并確保管路與色譜柱連接恰當(dāng),、無死體積,。

當(dāng)使用小顆粒填料（如2.5 μm）短柱進(jìn)行高效快速分離時，需要考慮以下因素：

• 確保管路與色譜柱連接恰當(dāng),、無死體積,，盡量優(yōu)化系統(tǒng)減少譜帶展寬；

• 提高采樣頻率至10點(diǎn)/秒以上,；

• 較小粒徑的色譜柱產(chǎn)生的柱壓較高,，而較小粒徑要達(dá)到理想色譜效率所需的線速度較高，請根據(jù)所用LC系統(tǒng)的實(shí)際情況調(diào)節(jié)流速,；

• 可使用較高的柱溫來補(bǔ)償小顆粒造成的壓力升高,，例如40?C。使用雜化顆粒反相色譜柱時,，可使用45?C或更高,。

進(jìn)行實(shí)際樣品分析的推薦步驟：

1. 確保流動相潔凈，每隔24-48小時就應(yīng)新配水相流動相,，并同時更換或仔細(xì)清洗流動相溶劑瓶,，以避免流動相長菌。確保實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)工作正常,。

2. 確保樣品不含顆粒型雜質(zhì),。如樣品過臟，或有微粒存在,，需要考慮適合的樣品制備方法,。在使用樣品過濾器時，確保濾膜為0.22 μm,，且與樣品溶劑完全兼容（不發(fā)生溶解）,。也可考慮使用高速離心法去除顆粒性雜質(zhì)，例如8000 rpm轉(zhuǎn)速以上離心20分鐘后,，移取樣品上清液進(jìn)樣,。

3. 確保樣品溶液與流動相條件兼容，進(jìn)樣后不會發(fā)生沉淀、或溶劑不互溶情況,。通常使用流動相或比流動相洗脫強(qiáng)度弱的溶液（即有機(jī)溶劑比例較低）溶解或稀釋樣品,，這樣可以獲得優(yōu)異的峰形和檢測靈敏度。

4. 如系統(tǒng)在線混合生成流動相,，預(yù)先檢查流動相各組分的兼容性,。例如，當(dāng)磷酸鹽緩沖液與高濃度乙腈（例如≥70%）混用時,，可能發(fā)生鹽析出,。

5. 了解色譜柱的操作使用限度。如果所使用的流動相條件,、柱溫、以及樣品溶液條件,，不利于色譜柱壽命時,，請使用保護(hù)柱以延長柱壽命。

6. 在使用流動相進(jìn)行柱平衡之前,，如果流動相中含有可能析出的緩沖鹽,，先使用5倍柱體積的有機(jī)溶劑-水溶液進(jìn)行過渡。例如,，在使用40/60 甲醇/磷酸鹽緩沖液流動相之前,，先使用5倍柱體積的40/60 甲醇/純水溶液沖洗色譜柱。

7. 在常規(guī)分析過程中,，每針或間隔若干針清洗柱內(nèi)可能積累的污染物,。完成分析后，徹底清洗色譜柱,，除去柱內(nèi)緩沖鹽和污染物,。

8. 在色譜柱使用過程中，定期進(jìn)行柱效測試,，記錄塔板數(shù)與壓力,，從而追蹤監(jiān)控色譜柱的性能變化。柱效測試方法應(yīng)固定,。

9. 反相色譜柱應(yīng)保存于合適的高比例或100%有機(jī)相（如乙腈或甲醇）中,。如色譜柱使用于高溫或極端PH條件，或停用色譜柱超過72小時,，用100%乙腈保存色譜柱,。

10. 使用原配的柱堵頭，確保堵頭擰緊以避免柱內(nèi)溶劑揮發(fā),。取放色譜柱時避免磕碰掉落,。

柱清洗與再生的推薦步驟：

  壓力升高，色譜柱峰形發(fā)生變化如出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾、肩峰甚至峰分岔,，分離度降低,，這些都強(qiáng)烈提示色譜柱受到污染?？刹捎靡韵虏襟E處理：

1. 如系統(tǒng)接有在線過濾器和保護(hù)柱,，首先排查在線過濾器與保護(hù)柱，進(jìn)行更新替換,。日常操作中,，當(dāng)壓力升高10%或柱效降低10%時，就應(yīng)考慮更換在線過濾器和/或保護(hù)柱,。

2. 使用高比例的有機(jī)溶劑進(jìn)行沖洗（請注意避免鹽析出,，通常可使用梯度升高法,，然后維持在高比例甚至100%有機(jī)溶劑條件下）,。此操作通常可洗去大部分污染物,。

3. 如有機(jī)溶劑清洗不能解決問題,，可采用如下方法進(jìn)行色譜柱的清洗和再生。根據(jù)樣品性質(zhì)以及你所了解的污染物性質(zhì)選擇清洗方法,，用20倍柱體積（即,，對于4.6x250      mm柱，相當(dāng)于80 mL）的HPLC級溶劑清洗色譜柱,，將流動相溫度升至35-55?C可提高清洗效率,。

4. * 注意防止緩沖鹽析出,，可調(diào)整為適當(dāng)比例的異丙醇和水的混合溶液
        
        

5. ** 除非確保您的系統(tǒng)與四氫呋喃和正己烷完全兼容,，否則四氫呋喃或正己烷只有在色譜柱無法用反相有機(jī)溶劑如乙腈清洗干凈時才考慮使用。降低流速及操作溫度,，并盡量減少系統(tǒng)在四氫呋喃和正己烷中的暴露時間,。

6. 可以考慮對色譜柱進(jìn)行倒沖，特別是當(dāng)問題表現(xiàn)為壓力急劇升高,，提示有顆粒型物質(zhì)直接堵塞于色譜柱入口端篩板處時,。操作時,，將色譜柱倒接，并與檢測器斷開,。使用低流速0.2 ml/min,，進(jìn)行過夜沖洗，并封堵檢測器入口及出口端以免溶劑揮干產(chǎn)生氣泡,。甚或,，將色譜柱小心的打開，直接更換柱入口端篩板,。注意,！這類操作需要技巧，僅作問題確實(shí)無法得到有效解決時的最后嘗試,，或供某些經(jīng)驗(yàn)豐富的分析操作人員參考使用,。