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    PCR檢測(cè)微量感染因子時(shí),，容易因?yàn)槲廴镜亩鴮?dǎo)致各種問(wèn)題,，因此，進(jìn)行PCR操作時(shí),，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程,，zui大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。

   （1）劃分操作區(qū)：目前,，普通PCR尚不能做到單人單管,，實(shí)現(xiàn)*閉管操作，但無(wú)論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行,，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：

    ① 標(biāo)本處理區(qū),，包括擴(kuò)增摸板的制備；

    ②PCR擴(kuò)增區(qū),，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增,；

    ③ 產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析,，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備,。

    各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材,，要有一定的方向性,。如：標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。

    切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū),。

   （2）分裝試劑：PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝,。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來(lái)吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來(lái)源的DNA：

    ①PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水,；

    ② 引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制,；

    ③ 引物和dNTP應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間,，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因,。

   (3) 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一,。因此,，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集,、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：

    ① 戴一次性手套,，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套,；

    ② 使用一次性吸頭,，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中,，避免氣溶膠的污染,；

    ③ 避免反應(yīng)液飛濺，打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況,，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底,。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面,；

    ④ 操作多份樣品時(shí),，制備反應(yīng)混合液,，先將dNTP、緩沖液,、引物和酶混合好,，然后分裝，這樣即可以減少操作,，避免污染,，又可以增加反應(yīng)的度；

    ⑤ zui后加入反應(yīng)模板,，加入后蓋緊反應(yīng)管,；

    ⑥ 操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性,，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性,；

    ⑦ 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器zui容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染,，使用可替換或高壓處理的加樣器,。如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該,，不能交叉使用,，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)；

    ⑧ 重復(fù)實(shí)驗(yàn),，驗(yàn)證結(jié)果,。