一,、基本理論
(一)分子篩效益
一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經(jīng)凝膠色譜柱時(shí),，各分子在柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行著兩種不同的運(yùn)動(dòng)：垂直向下的移動(dòng)和無定向的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。大分子物質(zhì)由于直徑較大,，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔,，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時(shí)向下移動(dòng)的速度較快,。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外,，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，即進(jìn)入凝膠相內(nèi),，在向下移動(dòng)的過程中,，從一個(gè)凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散,，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì),，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出,，分子小的后流出,，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。具有多孔的凝膠就是分子篩,。各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍,，有大極限和小極限。分子直徑比凝膠大孔隙直徑大的,，就會(huì)全部被排阻在凝膠顆粒之外,，這種情況叫全排阻。
兩種全排阻的分子即使大小不同,，也不能有分離效果,。直徑比凝膠小孔直徑小的分子能進(jìn)入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進(jìn)入凝膠孔隙,，即使它們的大小有差別,，也不會(huì)有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍,。綜上所述,，在凝膠色譜中會(huì)有三種情況，一是分子很小,，能進(jìn)入分子篩全部的內(nèi)孔隙;二是分子很大,，*不能進(jìn)入凝膠的任何內(nèi)孔隙;三是分子大小適中，能進(jìn)入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)的部分,。大,、中、小三類分子彼此間較易分開,，但每種凝膠分離范圍之外的分子,，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。
對(duì)于分子大小不同,，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)各種分子,，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進(jìn)入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內(nèi)，而分子的可進(jìn)入較多的凝膠顆粒內(nèi),，這樣分子較大的在凝膠床內(nèi)移動(dòng)距離較短,，分子較小的移動(dòng)距離較長。于是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的后通過凝膠床,，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離,。另外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),，大的分子在通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的孔隙時(shí)阻力較大,，小分子通過時(shí)阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時(shí),，按照分子量大小“排隊(duì),，凝膠表現(xiàn)分子篩效應(yīng)。
(二)色譜柱的重要參數(shù)
?、胖w積：柱體積是指凝膠裝柱后,，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床,，因引柱體積又稱“床”體積,，常用Vt 表示。
?、仆馑w積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙,，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積,，常用Vo表示。
⑶內(nèi)水體積：因?yàn)槟z為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),，顆粒內(nèi)部仍有空間,，液體可進(jìn)入顆粒內(nèi)部，這就分間隙的總和為內(nèi)水體積,，又稱定相體積,，常用Vi表示。
不包括固體支持物的體積(Vg),。
?、确逑疵擉w積：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液有體積，常用Ve
表示,。當(dāng)使用樣品的體積很少時(shí),，(與洗脫體積比較可以忽略不計(jì))，在洗脫圖中,，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve,。
當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時(shí)，洗脫體積計(jì)算可以從樣品體積的一半到峰頂位置,。當(dāng)樣品很大時(shí),，洗脫體積計(jì)算可以從應(yīng)用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點(diǎn)(或半高處)。
?、臩ephadex
G交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephndex,，不同規(guī)格型號(hào)的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍,。例如,，G-25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水20克,。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10,，G-15，G-25,，G-50,，G-75，G-100,，G-150,，和G-200。因此,，“G”反映,，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍,。
?、芐ephadex LH-20,，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及親脂溶劑,，用于分離不溶于水的物質(zhì),。
(二)瓊脂糖凝膠：
瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級(jí)鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度,。一般情況下,，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用(如水,，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液),。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，也不能高壓消毒,，可用化學(xué)滅菌活處理,。
(三)聚丙烯酰胺凝膠：
是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位,，
由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的,，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號(hào)的凝膠,。交聯(lián)劑越多,，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠-P (Bio-Gel P),，由美國Bio-Rod廠生產(chǎn),，型號(hào)很多，從P-2至P-300共10種,，P 后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度,。
(四)聚苯乙烯凝膠商品為Styrogel ， 具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu),，
可用于分離分子量1600到40,，000，000的生物大分子,，適用于有機(jī)多聚物,，分子量測定和脂溶性天然物的分級(jí)，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好,，洗脫劑可用甲基亞砜,。
三、實(shí)驗(yàn)技術(shù)
(一)層析柱
層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體,，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管,。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大,，可加大柱的直徑,，一般制備用凝膠柱,，直徑大于2厘米，但在加樣時(shí)應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上,。此外,，
直徑加大，洗脫液體體積增大,，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高,，為分離不同組分,，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān),，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞,，一般不超過1米。分族分離時(shí)用短柱,，一般凝膠柱長20-30厘米,，柱高與直徑的比較5:1─10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍,。
分級(jí)分離時(shí)柱高與直徑之線為20:1─100:1,，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米,。層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小,，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大,，其結(jié)果是影響洗脫峰形,，出現(xiàn)拖尾出象，降低分辯力,。在精確分離時(shí),，死體積不能超過總床體積的1/1000。
(二)凝膠的選擇
根據(jù)所需凝膠體積,，估計(jì)所需干膠的量,。 一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例Sephadex G-20的吸水量為20,，1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝膠體積約40ml,。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細(xì)胞分離效果好,，但阻力大,，流速慢。一般實(shí)驗(yàn)室分離蛋白質(zhì)采用100-200號(hào)篩目的的Sephadex G-200效果好,， 脫鹽用Sephadex G-25,、G-50,，用粗粒，短柱,，流速快,。
(三)凝膠的制備
商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹,，可用加熱法,，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大中速膨脹,，通常在1-2小時(shí)內(nèi)即可完成,。特別是在使用軟膠時(shí)， 自然膨脹需24小時(shí)至數(shù)天,，而用加熱法在幾小時(shí)內(nèi)就可完成,。這種方法不但節(jié)約時(shí)間，而且還可消毒,，除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣,。
(四)樣品溶液的處理 樣品溶液如有沉淀應(yīng)過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過Sephadex G-15短柱除去,。樣品的粘度不可大,，含蛋白為超過4%，粘度高影響分離效果,。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定,。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4%(一般約0.5-2ml)，進(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床的10%,，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí),，樣品可達(dá)凝膠床的20-30%。
分級(jí)分離樣品體積要小,，使樣品層盡可能窄,，洗脫出的峰形較好。
(五)防止微生物的污染 交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì),，防止微生物的生長,，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有:
?、暖B氨鈉(NaN3)在凝膠層析中只要用0.02%疊氮鈉已足夠防止微生物的生長,，疊氮鈉易溶一水，在20℃時(shí)約為40%;它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用,，因此疊氮鈉不影響抗體活力;不會(huì)改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我特性,。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。
?、瓶蓸吠猍Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02%,。在微酸性溶液中它的殺菌效果比較好,，在強(qiáng)堿性溶液中或溫度高于60℃時(shí)易引起分解而失效。
?、且一鷰€基水楊酸鈉 在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0.
01%,。在微酸性溶液中zui為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合,，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果,。
⑷苯基汞代鹽
在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01%,。在微堿性溶液中抑效果比較好,，長時(shí)間放置時(shí)可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀;還原劑可引起此化合物分解;含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用,。
一、 實(shí)驗(yàn)室要求：
凝膠色譜儀所使用流動(dòng)相多為有毒的有機(jī)性試劑,，實(shí)驗(yàn)室要保持良好的通風(fēng)條件,，試劑需專柜保存。實(shí)驗(yàn)室溫度需保持在10℃~35℃,，濕度小于80%,。周圍無腐蝕性氣體，無塵土飛揚(yáng),。
二,、實(shí)驗(yàn)臺(tái)要求：
實(shí)驗(yàn)臺(tái)要求通水電良好，電源為220V±20 V,，電源頻率為50Hz±0.5 Hz,，無劇烈震動(dòng)。
三,、儀器擺放要求：
儀器放在無陽光直射的地方,，不要放在靠門、窗的地方,，以減少空氣,、陽光對(duì)儀器帶來的影響。
四,、儀器操作：
樣品經(jīng)充分溶解后,，再用過濾器過濾后才可使用;流動(dòng)相也需現(xiàn)配后，再過濾使用;所有選用試劑均需選用色譜純?cè)噭?。新色譜柱初次使用流速設(shè)置為0.2ml/min,，沖洗1小時(shí)后再接檢測器。儀器需專人經(jīng)培訓(xùn)合格后才可使用,，嚴(yán)格控制流速,、壓力,。
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