HPLC是上世紀(jì)六七十年代發(fā)展起來(lái)的新型分離分析技術(shù),，廣泛應(yīng)用在制藥,、化工、環(huán)境,、食品等領(lǐng)域,，各行業(yè)實(shí)驗(yàn)室均能看到大量HPLC身影。
HPLC系統(tǒng)由脫氣機(jī)(內(nèi)置,、外置),、泵、自動(dòng)(手動(dòng))進(jìn)樣器,、柱溫箱(選配),、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等模塊構(gòu)成,。
HPLC實(shí)驗(yàn)室儀器管理
針對(duì)每臺(tái)儀器建立檔案及標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程SOP
每臺(tái)HPLC檔案需包括：品牌,、產(chǎn)地、主體流路材質(zhì)(兼容溶劑),、耐壓范圍,、正相系統(tǒng)或反相系統(tǒng)(主要看泵密封圈材質(zhì))、對(duì)應(yīng)維修工程師及應(yīng)用工程師的電話(huà),。保證出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)快速聯(lián)系獲取解決方案,，將儀器的損害盡可能的降低。
HPLC主體流路材質(zhì)一般有不銹鋼SST,、鈦Ti或MP35N(MP35N合金是一種無(wú)磁的鎳鈷鉻鉬合金),，普通液相系統(tǒng)無(wú)特殊說(shuō)明一般為不銹鋼系統(tǒng)，鈦或MP35N多用于BioHPLC系統(tǒng)中,，比不銹鋼系統(tǒng)更耐腐蝕,，和更好的生物兼容性,。
針對(duì)每臺(tái)儀器編寫(xiě)完整的操作規(guī)程，應(yīng)涉及到電壓,、開(kāi)關(guān)機(jī)順序及注意事項(xiàng),，使用人在申用儀器時(shí)應(yīng)注意儀器的情況，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)記錄并上報(bào),。對(duì)儀器的使用和維護(hù)記錄嚴(yán)格審核,。
物料管理
所有進(jìn)入液相色譜系統(tǒng)的溶劑均應(yīng)是色譜純,，樣品應(yīng)經(jīng)過(guò)相應(yīng)的前處理,，確保樣品的潔凈度，不會(huì)堵塞和污染系統(tǒng),。使用的進(jìn)樣小瓶規(guī)格要與自動(dòng)進(jìn)樣器匹配,，瓶子隔墊要與樣品溶劑兼容。如需過(guò)濾,，應(yīng)選擇與溶劑兼容的濾膜材質(zhì),，避免濾膜溶脹或反應(yīng)等結(jié)果導(dǎo)致樣品污染或系統(tǒng)堵塞等問(wèn)題。
相關(guān)規(guī)定
(1)儀器申用的規(guī)范化預(yù)約：有電子平臺(tái)在電子平臺(tái)上申請(qǐng)預(yù)約,，沒(méi)電子平臺(tái)可制定手工或電子臺(tái)賬記錄具體情況,。
(2)制定并嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)定。
(3)嚴(yán)格按照儀器SOP規(guī)定使用,。
(4)完善使用記錄的書(shū)寫(xiě),，執(zhí)行復(fù)核審查。
(5)儀器的維護(hù)規(guī)程的制定與執(zhí)行,。
環(huán)境要求
儀器使用環(huán)境應(yīng)無(wú)塵,，通風(fēng)良好，溫度保持在(15-30)℃,，室內(nèi)相對(duì)濕度應(yīng)在5%-85%范圍內(nèi),，儀器應(yīng)平穩(wěn)的放在試驗(yàn)臺(tái)上，周?chē)鸁o(wú)強(qiáng)烈機(jī)械振動(dòng)和電磁干擾源,。電壓應(yīng)符合響應(yīng)廠(chǎng)商的安裝使用要求,。
HPLC維護(hù)
目前各廠(chǎng)商生產(chǎn)制造的液相色譜儀主要分兩類(lèi)，一類(lèi)是一體機(jī),，另一類(lèi)是模塊化分體機(jī),。一體機(jī)體積小巧、安裝,、移機(jī)便捷;分體機(jī)維修方便,，各有優(yōu)勢(shì)。對(duì)于這兩類(lèi)液相系統(tǒng)總體維護(hù)是相似的,。
液相色譜系統(tǒng)分為脫氣機(jī)(包括內(nèi)置和外置兩種),、泵,、自動(dòng)進(jìn)樣器(手動(dòng)進(jìn)樣閥)、柱溫箱,、檢測(cè)器等功能模塊,。
1、脫氣機(jī)的維護(hù)：
為避免脫氣機(jī)污染：應(yīng)嚴(yán)格過(guò)濾并定期更新溶劑,，定期潤(rùn)洗脫氣機(jī)溶劑通道,，對(duì)于走水相的通道這點(diǎn)非常重要。使用有機(jī)溶劑充分的潤(rùn)洗所有通道(使用干凈的溶劑瓶),，在使用水和乙腈或甲醇作為流動(dòng)相時(shí)每周充分潤(rùn)洗脫氣機(jī)通道一次,。然而在色譜中反復(fù)出現(xiàn)鬼峰時(shí)，應(yīng)及時(shí)調(diào)整潤(rùn)洗周期,，并按下面的步驟進(jìn)行相應(yīng)的潤(rùn)洗,。
在泵出口安裝背壓管，并調(diào)整壓力至200-300bar
用20%的硝酸在常規(guī)流速下沖洗1小時(shí)(使用新鮮的HPLC級(jí)水)
用HPLC級(jí)水潤(rùn)洗通道知道PH測(cè)試為中性
再用HPLC級(jí)乙腈在常規(guī)流速下潤(rùn)洗2小時(shí)
用干凈的溶劑瓶裝上新配置的流動(dòng)相并與脫氣機(jī)連接
安裝新的溶劑過(guò)濾器
拆除背壓管并重新按照要求連接系統(tǒng)
平衡系統(tǒng)
有些品牌的液相色譜儀只有反相脫氣包,，當(dāng)使用正相系統(tǒng)時(shí),，要求短接脫氣機(jī)。有些品牌亦有正相脫氣包,，使用時(shí)應(yīng)注意,，避免溶劑對(duì)脫氣包材質(zhì)造成不可逆的損壞。
2,、溶劑吸濾頭維護(hù)
室溫較高時(shí),，使用純水相或有機(jī)相比例較低時(shí)，流動(dòng)相應(yīng)臨用現(xiàn)配及時(shí)清洗吸濾頭以防吸濾頭堵塞,。
定期檢查溶劑過(guò)濾頭,，尤其是水及相似溶劑作為流動(dòng)相時(shí)，細(xì)菌等微生物及其代謝產(chǎn)物容易沉淀堵塞濾頭,。所以定期更換溶劑,，并在清潔溶劑瓶后重新裝入新的溶劑，必要時(shí),，更換新的溶劑濾頭,。
3、泵的維護(hù)
泵的易損件主要為單向閥,、過(guò)濾白頭,、柱塞桿、柱塞密封圈等,，做好泵頭的維護(hù),，反相系統(tǒng)使用緩沖鹽時(shí)應(yīng)使用seal wash清洗，如沒(méi)有自動(dòng)后密封清洗系統(tǒng),，可以手動(dòng)清洗,，當(dāng)使用正相系統(tǒng)時(shí)選擇適宜的溶劑清洗,。
應(yīng)注意有些品牌的后密封清洗系統(tǒng)的溶劑瓶是循環(huán)的，有些品牌是非循環(huán)利用的,，對(duì)于循環(huán)式的后密封清洗系統(tǒng)應(yīng)定期更換儲(chǔ)液瓶中的溶劑,，避免溶劑中緩沖鹽濃度過(guò)高起不到清洗的作用，以及溶劑瓶中滋生微生物,。對(duì)于非循環(huán)的溶劑瓶除了定期更換溶劑外還應(yīng)注意,，不要讓溶劑瓶中的溶劑跑空。
如果要使用了高濃度鹽類(lèi)流動(dòng)相(通常大不超過(guò)1moL/L),，在后密封清洗系統(tǒng)沒(méi)有充分運(yùn)行(大于5min)的情況下,，嚴(yán)禁運(yùn)行泵，否則將造成柱塞桿及柱塞密封的損壞,。
泵的部件中有peek(聚醚醚酮)材質(zhì)組件,，在使用lv仿CHCL3,，四氫fu喃THF,，二甲基亞砜DMSO等溶劑時(shí)，peek材質(zhì)的管線(xiàn)或其他部件會(huì)發(fā)生溶脹現(xiàn)象,，建議更換耐受以上溶劑的不銹鋼備件或鈦或者M(jìn)P35N等材質(zhì)的備件,。
4、Purge閥維護(hù)
不要用工具來(lái)擰緊purge閥,，過(guò)緊可能會(huì)損壞密封墊,，并且必須在系統(tǒng)壓力為0時(shí)的情況打開(kāi)或者關(guān)閉purge閥。
5,、在線(xiàn)過(guò)濾器
purge中含有在線(xiàn)過(guò)濾器,，當(dāng)系統(tǒng)背壓高時(shí)考慮更換新的在線(xiàn)過(guò)濾器濾芯。有些品牌是主動(dòng)閥或者被動(dòng)閥,，需要更換閥中的過(guò)濾白頭,。
通常情況下，泵的柱塞密封墊由*分子量聚乙烯(UHMW-PE)材料制成,。當(dāng)使用lv仿,、三氯代苯、二氯甲烷,、四氫fu喃或甲苯做溶劑時(shí)會(huì)對(duì)UHMW-PE密封墊造成化學(xué)損傷,。在使用四氯化碳、二yi醚,、yi醚,、二異丙醚、酮類(lèi),、甲苯,、甲基環(huán)已胺及氯苯時(shí)還可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng),。不同制造商的密封墊材質(zhì)有不同，有些是PTFE材質(zhì)的還有石墨的,。
6,、自動(dòng)進(jìn)樣器的維護(hù)
不同品牌的自動(dòng)進(jìn)樣器結(jié)構(gòu)有所差異，應(yīng)詳見(jiàn)廠(chǎng)商說(shuō)明書(shū)做好維護(hù),。洗針液應(yīng)定期更換,，當(dāng)使用內(nèi)插管進(jìn)樣瓶時(shí)，應(yīng)及時(shí)調(diào)整進(jìn)樣針高度,，避免對(duì)硬件造成損傷,，當(dāng)出現(xiàn)進(jìn)樣體積重復(fù)性不好的情況時(shí)，排除儀器故障問(wèn)題,，由于進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)負(fù)壓造成的,，對(duì)于高沸點(diǎn)難揮發(fā)的樣品可選用欲開(kāi)口進(jìn)樣隔墊。
定期檢查進(jìn)樣針位置,，防止進(jìn)樣時(shí)扎偏損壞硬件,。
溶劑的選擇：
所有不銹鋼、鈦合金,、及寶石PCTFE聚三氟氯乙烯,、PTFE聚四氟乙烯、peek聚醚醚酮等材質(zhì)制造的部件都長(zhǎng)期浸泡在溶劑中,。
必須使用與管道材質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)試劑盒緩沖鹽溶液,。特別注意類(lèi)似高粘度、低沸點(diǎn),、有紫外吸收(UV-VIS檢測(cè)器),、高折射率(RID檢測(cè)器)及可揮發(fā)溶劑(脫氣機(jī))
高濃度緩沖鹽溶劑，通常大不超過(guò)1moL/L,，使用時(shí)應(yīng)確認(rèn)后密封清洗系統(tǒng)運(yùn)行再正確的清洗溶劑上,。
自動(dòng)進(jìn)樣器大致分為兩類(lèi)不帶溫控的自動(dòng)進(jìn)樣器和帶溫控的自動(dòng)進(jìn)樣器，對(duì)于可進(jìn)行溫控的自動(dòng)進(jìn)樣器要注意及時(shí)清理冷凝水,，定期清洗樣品盤(pán)避免進(jìn)樣針堵塞
針座漏液需要更換針座密封,，針座堵了可以通過(guò)反沖的方式解決。
進(jìn)樣閥如漏液需更換進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)子密封等組件,。
7,、柱溫箱的維護(hù)
一般沒(méi)有需要特殊維護(hù)的地方
8、檢測(cè)器的維護(hù)
檢測(cè)器需要維護(hù)的部件主要是燈和流通池,。定期檢測(cè)燈能量,，必要時(shí)更換燈。當(dāng)結(jié)果譜圖出現(xiàn)異常時(shí)確認(rèn)是否是流通池污染導(dǎo)致的,，及時(shí)清洗流通池,。
常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案：
壓力問(wèn)題
1,、壓力低
(1)低粘度流動(dòng)相 解決辦法：使用Kozeny-Carmen或類(lèi)似方程計(jì)算預(yù)期壓力
(2)活塞密封墊泄漏 解決辦法：檢查是否存在漏液現(xiàn)象，必要時(shí)更換相關(guān)部件
(3)系統(tǒng)泄漏 解決辦法：檢查是否有漏液,，擰緊或更換相關(guān)漏液部件
(4)系統(tǒng)中有氣泡 解決辦法：確保溶劑瓶或溶劑管線(xiàn)經(jīng)過(guò)*灌洗,，且purging閥*關(guān)閉，脫氣機(jī)正常工作,。
(5)溶劑過(guò)濾吸頭,、單向閥及管線(xiàn)等壓力傳感器之前的部件堵塞。解決辦法：用分段排除法檢查系統(tǒng)管路是否堵塞,。
(6)泵流速故障 解決辦法：用計(jì)量過(guò)的器皿判斷泵流量是否準(zhǔn)確,，確認(rèn)故障報(bào)修。
2,、壓力高
(1)高粘度流動(dòng)相 解決辦法：使用Kozeny-Carmen或類(lèi)似方程計(jì)算預(yù)期壓力
(2)泵流速故障 解決辦法：用計(jì)量過(guò)的器皿判斷泵流量是否準(zhǔn)確,，確認(rèn)故障報(bào)修。
(3)壓力傳感器之后的管路堵塞,、檢測(cè)器流通池,、自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣針或針座堵塞。解決辦法：用分段排除法確定堵塞的位置,，沖洗(反沖)或更換相關(guān)部件,。
(4)保護(hù)柱或分析柱堵塞,。解決辦法：沖洗(反沖)或更換相保護(hù)柱或分析柱,。
3、壓力波動(dòng)
(1)單向閥堵塞造成 解決辦法：超聲清洗單向閥
(2)管路中有氣泡 解決辦法：重新purge管路
二,、基線(xiàn)問(wèn)題
1,、基線(xiàn)波動(dòng)、基線(xiàn)漂移
(1)系統(tǒng)未平衡 解決辦法：至少10倍柱體積平衡系統(tǒng),。注意室溫是否穩(wěn)定避免空調(diào)出風(fēng)口直吹儀器,。
(2)流通池中有氣泡 解決辦法:沖洗流通池
(3)保護(hù)柱被污染 解決辦法：更換保護(hù)柱
(4)檢測(cè)器污染 解決辦法：按照廠(chǎng)商要求清洗流通池
(5)溶劑被污染 解決辦法：更換溶劑
(6)檢測(cè)器燈能量低 解決辦法:更換相關(guān)燈
(7)梯度洗脫 解決辦法：使用純度更高的溶劑或選擇其他波長(zhǎng)，如還存此情況屬正?，F(xiàn)象
(8)系統(tǒng)泄漏 解決辦法：檢查泄漏位置,，擰緊或更換泄漏處部件。
(9)溫度波動(dòng) 解決辦法：使用柱溫箱,，如條件要求苛刻可使用柱前加熱模塊及柱后冷卻模塊,。控制室溫,，避免空調(diào)出風(fēng)口直吹儀器,。
(10)色譜柱污染 解決辦法：更換保護(hù)柱必要時(shí)更換分析柱
(11)泵未適當(dāng)混合溶劑 解決辦法;等度洗手動(dòng)混合，在梯度洗脫時(shí)如儀器為低壓系統(tǒng)確保比例閥正常工作,，如儀器時(shí)高壓系統(tǒng)確保泵流速混合器正常工作,。
(12)溶劑過(guò)濾器堵塞 解決辦法：超聲(浸泡)清洗溶劑過(guò)濾器,，應(yīng)注意材質(zhì)是否可以超聲。
三,、峰形問(wèn)題
1,、峰展寬
系統(tǒng)未平衡 解決辦法：用至少10倍柱體積平衡系統(tǒng)
進(jìn)樣溶劑過(guò)強(qiáng) 解決辦法：確保進(jìn)樣溶劑強(qiáng)度與流動(dòng)相強(qiáng)度相當(dāng)或更弱
進(jìn)樣體積過(guò)高 解決辦法：減少進(jìn)樣體積
柱外體積過(guò)高 解決辦法：減小樣品濃度
溫度波動(dòng) 解決辦法：使用柱溫箱
保護(hù)柱污染或失效 解決辦法：更換新的保護(hù)柱
分析柱污染或失效 解決辦法：沖洗色譜柱必要時(shí)更換色譜柱
柱外體積過(guò)大樣品擴(kuò)散 解決辦法：減小柱外體積
2、雙峰
(1)色譜柱過(guò)舊,，色譜柱填料有塌陷,，柱校低 解決辦法：更換色譜柱
(2)色譜柱污染 解決辦法：沖洗色譜柱
3、倒峰
(1)溶劑被污染或進(jìn)樣溶劑紫外吸收比流動(dòng)相低 解決辦法：更換新配置的溶劑,，第二種情況可以忽略
(2)檢測(cè)器信號(hào)正負(fù)極設(shè)置反了,，此時(shí)峰全部為負(fù) 解決辦法：更改檢測(cè)器設(shè)置
(3)RI檢測(cè)器未平衡 按廠(chǎng)商要求平衡系統(tǒng)
4、平頭峰
(1)檢測(cè)器過(guò)載 解決辦法：減小樣品濃度
(2)檢測(cè)器設(shè)置 解決辦法：檢查檢測(cè)器衰減并重新校零
5,、峰拖尾
(1)保護(hù)柱過(guò)舊 解決辦法：更換保護(hù)柱
(2)色譜柱過(guò)載 解決辦法：減小進(jìn)樣體積或減小進(jìn)樣濃度
(3)色譜柱柱校低 解決辦法：更換色譜柱,，對(duì)于有極性基團(tuán)容易與流動(dòng)相產(chǎn)生氫鍵易拖尾的化合物，可選擇雙重封端的色譜柱,，或在不影響分析結(jié)果的情況下,，加入掃尾劑，改善峰行,。
(4)色譜柱污染 解決辦法：沖洗甚至更換色譜柱
6,、峰前沿
(1)溶劑效應(yīng) 解決辦法：更換進(jìn)樣溶劑確保進(jìn)樣溶劑強(qiáng)度與流動(dòng)相相當(dāng)或更弱
(2)色譜柱過(guò)載 解決辦法：減小進(jìn)樣體積或濃度
7、峰面積重現(xiàn)性不好
(1)峰面積減小,，樣品降解解決辦法：新配置樣品,，對(duì)溫度敏感的生物樣品應(yīng)使用可控溫的自動(dòng)進(jìn)樣器
(2)峰面積過(guò)小，樣品濃度過(guò)低,，解決辦法：增大樣品濃度
(3)檢測(cè)器設(shè)置,，選擇合適的檢測(cè)波長(zhǎng)
(4)進(jìn)樣量錯(cuò)誤 解決辦法：檢查調(diào)整進(jìn)樣針高度確保進(jìn)樣量準(zhǔn)確，計(jì)量泵正常工作
(5)樣品粘度太大 解決辦法：延長(zhǎng)注射器的吸液時(shí)間
(6)檢測(cè)器燈能量低 解決辦法：更換燈
8,、鬼峰
系統(tǒng)中存在污染 解決辦法：排查溶劑,、流動(dòng)相、分析柱,、保護(hù)柱,、檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器,、管路等,，沖洗或更換被污染的試劑或原件。
保留時(shí)間漂移
系統(tǒng)未平衡好 解決辦法：延長(zhǎng)平衡時(shí)間
系統(tǒng)漏液 解決辦法：檢查漏液位置,，擰緊或更換接頭或管線(xiàn)
溫度波動(dòng) 解決辦法：使用柱溫箱,，控制室溫，避免空調(diào)直吹儀器
泵流量有誤差 解決辦法：聯(lián)系報(bào)修
比例閥或混合器故障 解決辦法：聯(lián)系報(bào)修
HPLC是我們工作中重要的儀器之一，俗話(huà)說(shuō)知己知彼百戰(zhàn)不殆,，我們充分了解了partner才能工作的更順利,，事半功倍。
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