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　　雞蛋過敏的人群為廣泛,國外已經(jīng)出臺了強制性標識食品過敏原的法規(guī),，而國內(nèi)只有針對出口食品過敏源成分的標準,，以實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)法和環(huán)介導等溫擴增檢測方法為主，需要開發(fā)制定高靈敏度的直接對常見致敏蛋白的定性定量方法,，并制定相應的標識法規(guī),。

　　目前用于過敏原檢測的手段主要有酶聯(lián)免疫(ELISA)法、PCR法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術,。ELISA法是基于蛋白質(zhì)的檢測技術,，是現(xiàn)在為成熟的方法，但是由于各種加工手段使蛋白質(zhì)存在不同程度的變性,，導致無法與抗體準確結合,，而且ELISA法不可避免存在交叉反應且通量低，因此不適于對雞蛋過敏原的準確定量。PCR法是基于DNA水平的檢測手段,，而非直接對致敏蛋白進行定量,，但雞蛋含有極少量的DNA，并且雞蛋和雞肉中的DNA沒有差異性,。近年來,，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法廣受關注，其基于特征肽段有效地解決了變性蛋白的定量檢測問題,，而且可以直接對蛋清致敏蛋白進行高靈敏度,、特異性和準確度的檢測。

　　質(zhì)譜檢測方法具有高靈敏度與特異性的優(yōu)勢,，可通過超液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術建立雞蛋過敏原卵白蛋白的定量檢測方法,，并進行線性關系、檢出限,、加標回收等方法學驗證,，將所建方法應用于實際商品中卵白蛋白的定量檢測，以期對食品中雞蛋過敏原的準確定量提供技術支持,。

　　1,、特征肽段的篩選

　　首先篩選卵白蛋白中的特征肽段。將前處理后的樣品直接注入Easy-nLC 1000納升液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜進行分離分析,，將所得的肽段信息利用ProteinPilot軟件和Uniprot數(shù)據(jù)庫分析處理,。與Uniprot數(shù)據(jù)庫結果比對后，得到多條肽段,。然后根據(jù)如下特征肽段的篩選原則進行特征肽段的篩選：以7～20 個氨基酸為宜;不含錯切或漏切的酶切位點;不含甲硫氨酸;具有穩(wěn)定的物理化學性質(zhì);進行定性定量分析時,，具有較好的靈敏度和峰形。終篩選到3 段響應值較好,、靈敏度較高的特征肽段,，分別為LTEWTSSNVMEER(LR-13)、GGLEPINFQTAADQAR(GR-16),、ELINSWVESQTNGIIR(ER-16),。所選擇的3 條肽段通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進行BLAST搜索，確定肽段的唯yi性,。

　　2,、流動相及多反應監(jiān)測參數(shù)優(yōu)化

　　實驗比較了乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸溶液2 種流動相體系在相同的洗脫程序條件下特征肽段的響應和出峰情況,。結果表明,，使用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相，特征肽段的響應和峰形都要優(yōu)于前者,，拖尾現(xiàn)象明顯改善,，穩(wěn)定性也有所提高,。在電噴霧離子源正離子模式下，加入甲酸有助于肽類物質(zhì)離子化進而提高分離效率和質(zhì)譜信號的強度,，故選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相,。

　　3、方法的線性關系,、LOD和LOQ結果

　　分別精密移取混標儲備液,，用水稀釋配制成1、2,、5,、10、20,、50,、100、200,、500,、1 000,、2 000,、5 000 ng/mL的標準溶液，分別以3 條特征肽段的色譜峰面積為縱坐標(Y),，以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(X)做線性回歸方程,，并計算該方法的線性范圍。

　　4,、基質(zhì)效應的評價

　　基質(zhì)效應大于100%時,，表明基質(zhì)對目標物離子化有增益作用;基質(zhì)效應小于100%時，表明基質(zhì)對目標物離子化有抑制作用,。結果表明,，餅干(95.05%)、面包(90.68%) ,、掛面(88.53%) 對特征肽段GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)有不同程度的減弱作用,，其中掛面的離子化抑制程度大;而蛋糕基質(zhì)(112.60%)對特征肽段GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)有增益作用。

　　5,、加標回收率測定結果

　　卵白蛋白中定量肽段GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)在基質(zhì)餅干1中回收率在83.32%～95.66%之間,，相對標準偏差(RSD)不大于9.97%;在基質(zhì)餅干2中回收率在80.76%～98.55%之間，RSD不大于8.59%; 在基質(zhì)掛面中回收率在77.22%～92.68%之間,，RSD不大于5.13%;在基質(zhì)蛋糕1中回收率在82.47%～86.56%之間,，RSD不大于4.88%;在基質(zhì)蛋糕2中回收率在79.41%～82.58%之間，RSD不大于8.31%;在基質(zhì)面包中回收率在85.13%～91.36%之間,，RSD不大于6.30%,。

　　結論

　　通過蛋白質(zhì)組學方法成功篩選到高特異性卵白蛋白肽段,，并采用電噴霧質(zhì)譜多反應監(jiān)測模式實現(xiàn)了高靈敏度、快速定量,。該方法的建立為食品中雞蛋過敏原的檢測提供了技術支持,，為推動我國食品過敏原標識的監(jiān)督與立法提供理論支持。