微生物培養(yǎng)基的制備步驟總共分為九步，每一步是如何操作的呢?接下來咱們就細(xì)細(xì)分解,。
用度1/100的電子天平稱取培養(yǎng)基所需藥品,。先根據(jù)配方計算出配制一定量培養(yǎng)基所需各種成分藥品的量，然后用天平準(zhǔn)確稱取,。稱量時用稱量紙折疊成簸箕狀盛放藥品,。稱量紙折疊方法如圖所示。
培養(yǎng)基放入燒杯中,，慢慢加入少量所需水,，邊加入邊用玻棒攪拌。如果培養(yǎng)基中不含有瓊脂,，培養(yǎng)基不需要加熱;如果含有瓊脂,，則需要用本生燈或電磁爐加熱煮沸，*溶解后,，再補齊所需水,，并攪拌均勻(如圖3所示)。如果配制的培養(yǎng)基量很大,，可用不銹鋼鍋加熱溶化,，可先用溫水加熱并隨時攪動，防止焦化,，如有焦化現(xiàn)象,，配制的培養(yǎng)基就不能使用，要重新配制,。
配制培養(yǎng)基時不可用銅或鐵的容器溶化,，因銅或鐵制容器可能會使培養(yǎng)基中的銅和鐵的含量超標(biāo)，影響實驗(培養(yǎng)基中銅含量大于0.3mg/L,，細(xì)菌不宜生長，鐵含量超過0.14mg/L,，妨礙細(xì)菌產(chǎn)毒素),。對容易發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀的藥品,，要分開溶解,，后加入培養(yǎng)基，如磷酸氫二鉀和硫酸鎂,。
雖然培養(yǎng)基中含有緩沖物質(zhì)成分,，能使培養(yǎng)基的pH盡可能的保持在要求的范圍內(nèi),，但是配出的培養(yǎng)基若不符合要求，就要進(jìn)行必要的調(diào)整,。如果有已校準(zhǔn)pH計,，可用pH計，如果沒有,，可用精密的pH試紙,，再根據(jù)需要用1 mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸(微調(diào)可用0.1氫氧化鈉或0.1mol/L鹽酸)調(diào)制所需的pH。
培基的pH一般為7.4～7.6,，也有酸性或堿性的,。用氫氧化鈉調(diào)整的需要高壓滅菌的培養(yǎng)基，在調(diào)整pH時要調(diào)至高出所需0.1個～0.2個單位,，因用氫氧化鈉調(diào)整時,，高壓滅菌后，培養(yǎng)基的pH要降低0.1~0.2,。如培養(yǎng)基中含有碳酸鈣成分,，可不用調(diào)pH。
配成的培養(yǎng)基,，若無特殊要求,，可省略此步。若有沉淀或渾濁需要澄清的液體培養(yǎng)基可用油紙過濾,。而固體培養(yǎng)基可用中間夾一薄層脫脂棉的雙層紗布過濾,。如果過濾法還不能達(dá)到澄清的要求，則可用蛋清澄清法,，即培養(yǎng)基加熱冷卻到50~60℃,，裝入三角瓶內(nèi)(不超過容量的二分之一)，按1000mL加人1個～2個雞蛋的蛋清,，用力搖晃3-5min,，高壓蒸汽滅菌121℃、20min,，取出趁熱過濾即可,。
配制好的培養(yǎng)基根據(jù)不同的用途分裝在三角瓶、試管等容器中,，分裝試管,，如果試管量很大，可用自動分液器,，如果試管量少,，可用漏斗分裝。
分裝量不超過容器容積的三分之二,。三角瓶以不超過容積的二分之一為宜;
瓊脂斜面以不超過試管長度的五分之一為宜,，滅菌后,，擺成的斜面為培養(yǎng)基量的三分之一，底層為三分之二的量為宜;
半固體瓊脂分裝量為試管長度的三分之一;
用來接種或保菌的高層瓊脂,，分裝量為試管長度的四分之一或三分之一,，用來接種厭氧菌的要達(dá)到三分之二;
瓊脂平板，內(nèi)徑為90mm的以13mL~15 mL為宜,，內(nèi)徑70mm的平板為8mL~10 mL,，制成的瓊脂平板若表面水分較多，可將平板倒扣,，放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)30min,，干燥后再用。
每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝一小玻璃瓶(約20mL)與該批培養(yǎng)基同時滅菌,，為測定該批培養(yǎng)基終pH,。
分裝好的培養(yǎng)基應(yīng)立即進(jìn)行滅菌。滅菌的方法種類如下：
1.高壓蒸汽滅菌法
大多耐熱培養(yǎng)基都可用此法,，小量分裝時,，用121℃，15min;滅菌量大時,，用121℃,，30min滅菌;含糖類的培養(yǎng)基只能113~115℃，15min滅菌,，避免糖類遭破壞,。
2.煮沸滅菌法
對含有不耐高溫物質(zhì)的培養(yǎng)基，可使用此方法,。
3.過濾除菌
以過濾的方法除菌,，用無菌操作技術(shù)，定量加入培養(yǎng)基,。血液,、抗生素可用無菌操作技術(shù)抽取，加入冷卻到50℃左右的培養(yǎng)基中,。培養(yǎng)基含有不耐熱的物質(zhì)時,，可用此法。
對LST培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時,，有時發(fā)酵管內(nèi)會有氣泡,。為防止發(fā)酵管內(nèi)產(chǎn)生氣泡，可以采取以下幾項措施：
1. 小倒管浸滿培養(yǎng)基(不留氣泡)后再加入到盛LST的試管中,。
2.滅菌鍋關(guān)閉放氣閥前,，將鍋內(nèi)氣體排干凈,。
3.試管塞不要塞得太緊(使用硅膠塞的時候),，勿使用橡皮塞,。
4.不要過早打開滅菌鍋，要等滅菌鍋內(nèi)氣壓和溫度都降到與室溫一致或相差不大時再打開滅菌鍋,。
如果以上情況都做到還有氣泡,，可用水做培養(yǎng)基組的對照試驗，若培養(yǎng)基組有氣泡,，而對照組沒有氣泡可確定是培養(yǎng)基自身的原因,。
滅菌融化的培養(yǎng)基冷卻到50℃后，倒入無菌干燥的培養(yǎng)皿中,。培養(yǎng)基的溫度不能過高,，否則容易在培養(yǎng)皿的內(nèi)蓋上形成太多的冷凝水;溫度太低，培養(yǎng)基又容易凝固成塊,，無法制成平板,。
倒平板時，應(yīng)在靠近酒精燈火焰進(jìn)行,，以免外界的雜菌落入平板內(nèi),，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿三角瓶的底部,，用左手的小指和手掌部位把三角瓶的棉塞拔下,，灼燒瓶口，用大拇指和食指把培養(yǎng)皿蓋打開一條縫,，至瓶口剛好伸入,，倒入培養(yǎng)基，以鋪滿底為限,，不超過培養(yǎng)皿高度的三分之一,，迅速蓋好蓋，放在桌面上,，輕輕地轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿,，使培養(yǎng)基分布均勻，冷凝后即可,。
裝在試管中的瓊脂培養(yǎng)基,，在滅菌完成后，趁熱立即擺放在木棒(或玻璃棒)上,，并成適當(dāng)?shù)男倍?，冷卻后，瓊脂凝固即成斜面,。斜面長度不用超過試管二分之一,。
培養(yǎng)基滅菌后仔細(xì)檢查一遍，發(fā)現(xiàn)有破裂、水分浸入,、色澤異常,、棉塞被培養(yǎng)基沾染，都要丟棄,，不能再用,。并測定其終pH。還需進(jìn)行無菌檢查和效果檢查,。無菌檢查是將滅菌后的培養(yǎng)基取1管(瓶)~2管(瓶),，37℃恒溫培養(yǎng)1d～2d，確定無雜菌生長;效果檢查是用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種在相關(guān)的培養(yǎng)基上檢查檢查菌的生長,、形態(tài)及生化情況,，與已知情況相符。兩種情況都合格,，配制的培養(yǎng)基方可使用,。
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