1.熱變性及酸堿變性沉淀法 用于選擇性的除去某些不耐熱及在一定PH值下易變性的雜蛋白,。
2.有機溶劑沉淀法 多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化,，有時也用于蛋白質(zhì)沉淀,。
3.等電點沉淀法 用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其它兩性物質(zhì)的沉淀,。但此法單獨應(yīng)用較少,，多與其它方法結(jié)合使用。
4.非離子多聚體沉淀法 用于分離生物大分子,。
5.生成鹽復(fù)合物沉淀 用于多種化合物,，特別是小分子物質(zhì)的沉淀。
6.鹽析法 多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化,。
鹽析法
一般來說,，所有固體溶質(zhì)都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過程叫鹽析,。在生化制備中,許多物質(zhì)都可以用鹽析法進行沉淀分離,，如蛋白質(zhì)、多肽,、多糖、核酸等,，其中以蛋白質(zhì)沉淀zui為常見,，特別是在粗提階段。
鹽析法分為兩類,，*類叫Ks分段鹽析法,，在一定PH和溫度下通過改變離子強度實現(xiàn)，用于早期的粗提液;第二種叫b分段鹽析法,，在一定離子強度下通過改變PH和溫度來實現(xiàn),，用于后期進一步分離純化和結(jié)晶。
一.影響鹽析的若干因素
1.蛋白質(zhì)濃度
高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量,，但許多蛋白質(zhì)的b 和Ks常數(shù)十分接近,，若蛋白濃度過高，會發(fā)生嚴(yán)重的共沉淀作用;在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析,，所用的鹽量較多,，而共沉淀作用比較少，因此需要在兩者之間進行適當(dāng)選擇,。用于分步分離提純時,，寧可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液,，多加一點中性鹽，使共沉淀作用減至zui低限度,。一般認(rèn)為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中,。
2.離子強度和類型
一般說來，離子強度越大,，蛋白質(zhì)的溶解度越低,。在進行分離的時候，一般從低離子強度到高離子強度順次進行,。每一組分被鹽析出來后,，經(jīng)過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度,，使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來,。
離子種類對蛋白質(zhì)溶解度也有一定影響，離子半徑小而很高電荷的離子在鹽析方面影響較強,，離子半徑大而低電荷的離子的影響較弱,，下面為幾種鹽的鹽析能力的排列次序：磷酸鉀>硫酸鈉>磷酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂。
3.PH值
一般來說,，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大,，凈電荷越少溶解度越小，在等電點時蛋白質(zhì)溶解度zui小,。為提高鹽析效率,，多將溶液PH值調(diào)到目的蛋白的等電點處。 但必須注意在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點與高鹽濃度下所測的結(jié)果是不同的,，需根據(jù)實際情況調(diào)整溶液PH值,，以達到的鹽析效果。
4.溫度
在低離子強度或純水中,，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加,。但在高濃度下，蛋白質(zhì),、酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降,。在一般情況下，蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求,，可在室溫下進行,，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進行。
二.硫酸銨的使用
硫酸銨中常含有少量的重金屬離子,，對蛋白質(zhì)巰基有敏感作用,，使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液，通入H2S飽和,，放置過夜,，用濾紙除去重金屬離子,，濃縮結(jié)晶，100℃烘干后使用,。另外,，高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性(PH=5.0左右)，使用前也需要用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需PH,。
硫酸銨的加入有以下幾種方法：1)加入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況;2)加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況;3)透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中,，然后浸入飽和硫酸銨中進行透析，透析袋內(nèi)硫酸銨飽和度逐漸提高,，達到設(shè)定濃度后,，目的蛋白析出，停止透析,。該法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性,，鹽析效果好，但手續(xù)煩瑣,，需不斷測量飽和度,，故多用于結(jié)晶，其它情況少見,。
使用固體硫酸銨時：1)必須注意飽和度表中規(guī)定的溫度,，一般有0℃或室溫兩種，加入固體鹽后體積的變化已考慮在表中;2)分段鹽析中,，應(yīng)考慮每次分段后蛋白質(zhì)濃度的變化,。一種蛋白質(zhì)如經(jīng)二次透析，一般來說,，*次鹽析分離范圍(飽和度范圍)比較寬,，第二次分離范圍較窄。3)鹽析后一般放置半小時至一小時,，待沉淀*后才過濾或離心。過濾多用于高濃度硫酸銨溶液,，因為此種情況下,，硫酸銨密度較大，若用離心法需要較高離心速度和長時間的離心操作,，耗時耗能,。離心多用于低濃度硫酸銨溶液。
有機溶劑沉淀法
有機溶劑的沉淀機理是降低水的介電常數(shù),，導(dǎo)致具有表面水層的生物大分子脫水,，相互聚集，zui后析出,。該法優(yōu)點在于：1)分辨能力比鹽析法高,，即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀;2)沉淀不用脫鹽,，過濾較為容易;3)在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。其缺點是對具有生物活性的大分子容易引起變性失活,，操作要求在低溫下進行,。總體來說,，蛋白質(zhì)和酶的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍,。
有機溶劑的選擇首先是能和水混溶，使用較多的有機溶劑是乙醇,、甲醇,、丙酮，還有二甲基甲酰胺,、二甲基亞砜,、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。
有多種因素影響有機溶劑的沉淀效果：1)溫度 低溫可保持生物大分子活性,，同時降低其溶解度,，提高提取效率;2)樣品濃度和PH 與鹽析法中的作用基本相同;3)金屬離子一些多價陽離子如Zn2+和Ca2+在一定PH下能與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物在水中或有機溶劑中的溶解度都大大下降,，而且不影響蛋白質(zhì)的生物活性,。4)離子強度 鹽濃度太大或太低都對分離有不利影響，對蛋白質(zhì)和多糖而言鹽濃度不超過5%比較合適,，使用的乙醇量不超過二倍體積為宜,。
其他沉淀法
一.等電點沉淀法
兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時溶解度zui低，不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點,，以此為基礎(chǔ)可進行分離,。如工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時，在粗提液中先調(diào)PH8.0去除堿性蛋白質(zhì),，再調(diào)PH3.0去除酸性蛋白質(zhì),。
利用等電點除雜蛋白時必須了解制備物對酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險,。 不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后,，等電點會發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時,，必須注意調(diào)整PH值,。 等電點法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用,，以提高其沉淀能力,。
二.生成鹽復(fù)合物沉淀法
1.金屬復(fù)合鹽法
許多有機物質(zhì)包括蛋白在內(nèi)，在堿性溶液中帶負(fù)電荷,，能與金屬離子形成沉淀,。根據(jù)有機物與它們之間的作用機制,，可分為羧酸、胺及雜環(huán)等含氮化合物類,，如銅鋅鎘;親羧酸疏含氮化合物類,，如親硫氫基化合物類。蛋白質(zhì)-金屬離子復(fù)合物的重要性質(zhì)是它們的溶解度對溶液的介電常數(shù)非常敏感,，調(diào)整水溶液的介電常數(shù)(如加入有機溶劑),，即可沉淀多種蛋白。
2. 有機鹽法
含氮有機酸如苦味酸,、苦酮酸,、鞣酸等能與有機分子的堿性功能團形成復(fù)合物而沉淀析出。但此法常發(fā)生不可逆的沉淀反應(yīng),，故用于制備蛋白質(zhì)時,，需采用較溫和的條件，有時還需加入一定的穩(wěn)定劑,。
3.無機復(fù)合鹽法
如磷鎢酸鹽,、磷鉬酸鹽等。
以上鹽類復(fù)合物都具有很低的溶解度,，極易沉淀析出,。若沉淀為金屬復(fù)合鹽，可通以H2S使金屬變成硫化物而除去,，若為有機酸鹽或磷鎢酸鹽,，則加入無機酸并用C4H10O萃取，把有機酸和磷鎢酸等移入C4H10O中除去,，或用離子交換法除去,。值得注意的是此類方法常使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀，應(yīng)用時必須謹(jǐn)慎,。
三. 選擇性變性沉淀
其原理是利用蛋白質(zhì),、酶和核酸等生物大分子對某些物理或化學(xué)因素敏感性不同，有選擇地使之變性沉淀,，以達到分離提純的目的,。
此方法可分為：1)利用表面活性劑或有機溶劑引起變性;2)利用對熱的不穩(wěn)定性,加熱破壞某些組分，而保存另一些組分;3)酸堿變性,。
四.非離子多聚物沉淀法
非離子多聚物是六十年代發(fā)展起來的一類重要沉淀劑，zui早用于提純免疫球蛋白,、沉淀一些細(xì)菌和病毒,，近年來逐漸廣泛應(yīng)用于核酸和酶的分離提純。這類非離子多聚物包括不同分子量的聚乙二醇,、NPEO,、葡聚糖,、右旋糖酐硫酸鈉等，其中應(yīng)用zui多的是聚乙二醇,。
用非離子多聚物沉淀生物大分子和微粒,，一般有兩種方法：1)選用兩種水溶性非離子多聚物組成液液兩相體系，不等量分配,，而造成分離,。此方法基于不同生物分子表面結(jié)構(gòu)不同，有不同分配系數(shù),。并外加離子強度,、PH值和溫度等影響，從而擴大分離效果,。2)選用一種水溶性非離子多聚物,，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出,。該方法操作時先離心除去大懸浮顆粒,，調(diào)整溶液PH值和溫度至適度，然后加入中性鹽和多聚物至一定濃度,，冷貯一段時間,，即形成沉淀。
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