開展 PCR 應具有一定的條件。需要一個正規(guī)的 pCR 實驗室,，采集標本,、核酸提取、擴增及產物分析應在不同的房間進行;需有嚴密的防污染措施,、假陽性和假陰性結果的質控等,。實驗者應具有一定的分子生物學理論知識及實驗技能，能夠及時發(fā)現和糾正實驗中的問題,。目前,，我國在 PCR 應用中尤其是在臨床診斷中存在問題較多，主要表現為： PCR 試劑的考核,、審查工作薄弱,，許多單位實驗條件不符合要求，部分操作人員的理論和實驗知識水平較低,。 PCR 的應用范圍過寬等,，因此造成 PCR 實驗結果的可靠性差，出現較多的假陽性,、假陰性結果,。
一、假陽性：
實驗中設立的陰性對照可提示有無假陽性結果出現,。如果一次實驗中的幾個陰性對照中出現一個或幾個陽性結果,，提示本次實驗中其它標本的檢測結果可能有假陽性,。造成假陽性的原因包括樣品污染、擴增試劑污染,、擴增產物交叉污染等,。常見的污染來源包括實驗室環(huán)境、加樣器,、操作中形成的噴霧,、 DNA 抽提儀器、試劑及任何與擴增產物接觸的東西,。預防措施：(1)工作區(qū)隔離,。(2)改進實驗操作，如在加樣過程中避免試劑飛濺,、吸頭離心管使用前高壓處理,、試劑分裝成小份一次使用后棄去等。(3)操作程序合理化,，如后加陽性對照等,。
交叉污染的處理方法： 交叉污染指擴增產物對將要擴增的樣品或反應管的污染。由于 PCR 的敏感性和效率特別高,，所以少量的擴增產物污染標本或反應管即可出現假陽性,。交叉污染的處理方法包括 [1] ：
1 .在 DNA 模板和多聚酶加入前，紫外線照射反應管內容物以破壞污染的 PCR 產物,。一般選用波長 254nm 照射 30min ( Nature ,， 1990 ， 34:27 )
2 . PCR 實驗中使用 dUTP ,，而不用 dTTP ,。在擴增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase (尿嘧啶糖基化酶)處理可降解交叉污染的 PCR 產物，而不降解基困組 DNA 模板,，然后熱滅活此酶，再進行擴增反應( Gene ,， 1990 ,， 93 ： 125 )。
3 .在 PCR 反應前加入一種光化學試劑,，反應完成后激活該試劑,，光化學試劑可交聯 DNA 鏈，使之不能再擴增( Nucleic Acids Res ,， 1991 ,， 19 ： 99 )。
二,、假陰性：
如果實驗中設置的陽性對照未能擴增成陽性結果,，提示本次實驗中可能有假陰性結果,。但這里應注意，許多國產 PCR 試劑盒中陽性對照采用質粒 DNA ,，和標本相比來說,，不需純化提取核酸的步驟，因此,，如果在標本核酸純化提取步驟有問題,，即使陽性對照均呈陽性，標本檢測中還可能有假陰性,。
造成假陰性的原因包括: (1) DNA 抽提過程不當,。 (2) DNA 樣品中含有 Taq 聚合酶抑制劑，如尿素,、 DMSO ,、 SDS 等物質，可抑制 Taq 酶活性,， DNA 樣品中的蛋白質和重金屬離子等亦影響 Taq 酶活性,，尤其是含有較多膿液或分泌物的標本，其中雖有待查菌,，但卻因標本處理不當而出現假陰性 [2] ,。
設置內對照是判斷假陰性較好的指示系統(tǒng)。在每一反應管中加入內對照,，若內對照未能擴增出來,，說明該反應管的結果可能有問題。
三,、PCR產物的鑒定
PCR 產物通過瓊脂糖凝膠電泳可判斷其長度是否為預期的長度,，但只有通過雜交試驗或序列分析等才能判斷其特異性。嚴格說來,， PCR 產物均應通過實驗證實其特異性,。在我國一些科研論文和臨床檢測中缺乏這一環(huán)節(jié)。
綜上所述,， PCR 具有其優(yōu)點,，但也有不足之處，它是一種很好的科研手段,，但作為常規(guī)診斷方法尚需進一步改進和提高 [9] ,。目前的關鍵問題是如何正確應用 PCR 。雖然 PCR 尚未在包括美國等發(fā)達國家作為常規(guī)診斷方法,，但如果具備開展 PCR 需要的條件,， PCR 是可作為輔助診斷手段使用的。目前,，只有針對 PCR 應用中存在的問題,，采取措施,，正確應用 PCR ，才能使這一技術在科研和臨床工作中發(fā)揮應有的作用,。
參考文獻
[1] Arnheim N, Erlich H. Polymerase chain reaction strategy. Annu Rev Biochem, 1992, 252:1643.
[2] 葉順章,，聚合酶鏈反應在性病診斷中的應用，中華皮膚科雜志,， 1996 ,， 29/p>
[3] Billiald P, Goyffon M, PCR: principles and prospects in clinical bilology. Ann Pharm Fr, 1995,53(4):155
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