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基因擴(kuò)增PCR的擴(kuò)增與克隆方法及一些使用的小建議
基因擴(kuò)增PCR主要有冰箱、超凈臺,、加樣器,、混勻器、天平等,。加樣器,、天平除了要外,還應(yīng)有定期校準(zhǔn),。試劑分裝應(yīng)在超凈臺中進(jìn)行,,擴(kuò)增反應(yīng)混合液應(yīng)使用分子生物學(xué)級的,試劑制備好后應(yīng)有質(zhì)檢:一是否有污染,、二是檢測試劑的擴(kuò)增效果。
基因擴(kuò)增PCR的擴(kuò)增與克隆方法:
?、僖锏男蛄袘?yīng)位于基因組DNA的高度保守區(qū),,且與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異性結(jié)合,,提高反應(yīng)的特異性
?、谝镩L度:15-40bp為宜。引物過短或過長均可使反應(yīng)的特異性下降,。
?、垡锏膲A基盡可能隨機(jī)發(fā)布,,避免出現(xiàn)數(shù)個嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列,G+C堿基的含量在40%-75%之間,。
?、芤飪?nèi)部應(yīng)避免形成二級結(jié)構(gòu),特別是引物的末端應(yīng)避免有回文結(jié)構(gòu),。
?、荻€引物不應(yīng)有互補(bǔ)序列,特別是3’端應(yīng)避免互補(bǔ),,以免形成“引物二聚體”,,浪費(fèi)引物。
?、抟?’末端堿基無嚴(yán)格限制,,在與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠的條件下,其5’端堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài),,因此可在引物5’端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),、啟動子序列或其它序列等以便于PCR產(chǎn)物的分析克隆等,引物的5’端至多可加10個堿基而對PCR反應(yīng)無影響,。
基因擴(kuò)增PCR的使用建議:
1,、使用本制品時務(wù)必將Buffer反復(fù)混勻后再加,避免因組分不一導(dǎo)致結(jié)果差異,;
2,、配置和分裝反應(yīng)液時請一定使用新的(無污染的)噴頭以避免污染;
3,、如擴(kuò)增條帶多,,可適當(dāng)添加酶和dNTPs;
4,、當(dāng)多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度均在1kb以內(nèi)時,,使用3%~4%濃度的Agarosegel進(jìn)行電泳分離效果。