超微量分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器,，主要設(shè)計(jì)用于生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)下述應(yīng)用領(lǐng)域：核酸的定量。

　　核酸的定量是超微量分光光度計(jì)使用頻率zui高的功能,?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈,、雙鏈DNA,，以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù),。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA,，30μg/ml的Olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。測(cè)試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積,，爾后測(cè)試空白液和樣品液,。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者zui頭痛的問(wèn)題,。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。

　　事實(shí)上,，超微量分光光度計(jì)設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度,。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測(cè)試時(shí),，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定,、離子濃度較低的緩沖液，如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù),。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果,。為了zui大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A,，吸光值在0.1-1.,。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小,，結(jié)果穩(wěn)定,。

　　從而意味著樣品的濃度不能過(guò)低，或者過(guò)高（超過(guò)光度計(jì)的測(cè)試范圍）,。zui后是操作因素,，如混合要充分，否則吸光值太低,，甚至出現(xiàn)負(fù)值,；混合液不能存在氣泡，空白液無(wú)懸浮物,，否則讀數(shù)漂移劇烈,；必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色杯,；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的zui小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。

　　除了核酸濃度,，分光光度計(jì)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,，如A260/A280的比值，用于評(píng)估樣品的純度,，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm,。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8或者2.0,，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物,，多肽，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子,。純樣品,，A320一般是0。

　　一,、蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）

　　這種方法是在280nm波長(zhǎng),，直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg公式,，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度,。

　　蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單,，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì),。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),，一般要消除320nm的“背景”信息，設(shè)定此功能“開(kāi)”,。與測(cè)試核酸類似,，要求A280的吸光值至少大于0.1A，*的線性范圍在1.0-1.5之間,。實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時(shí),，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上,，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過(guò)1%,，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。

　　漂移的原因是因?yàn)閃arburg公式吸光值換算成濃度,，乘以一定的系數(shù),，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì)被放大,，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定,。

　　蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈,、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì),。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，速度快,，操作簡(jiǎn)單,；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾,；另外敏感度低,，要求蛋白的濃度較高。

　　二,、比色法蛋白質(zhì)定量

　　蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),，產(chǎn)生有色物質(zhì),。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。

　　比色方法一般有BCA,，Bradford，Lowry等幾種方法,。

　　Lowry法：以zui早期的Biuret反應(yīng)為基礎(chǔ),，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng),，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物,。但是與Biuret相比，Lowry法敏感性更高,。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑,；反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng)；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響,；含EDTA,，Tritonx-100,，ammoniasulfate等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

　　BCA（Bicinchoninineacidassay）法：這是一種較新的,、更敏感的蛋白測(cè)試法,。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生Cu+，后者與BCA形成螯合物,，形成紫色化合物,，吸收峰在562nm波長(zhǎng)。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*,，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定,。相對(duì)于Lowry法，操作簡(jiǎn)單,，敏感度高,。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

　　Bradford法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng),，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm,。其zui大的特點(diǎn)是，敏感度好,，是Lowry和BCA兩種測(cè)試方法的2倍,；操作更簡(jiǎn)單，速度更快,；只需要一種反應(yīng)試劑,；化合物可以穩(wěn)定1小時(shí)，方便結(jié)果,；而且與一系列干擾Lowry，BCA反應(yīng)的還原劑（如DTT,，巰基乙醇）相容,。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的。zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,，無(wú)可比性,。

　　某些初次接觸比色法測(cè)定的研究者可能為各種比色法測(cè)出的結(jié)果并不一致，感到迷惑,，究竟該相信哪種方法,？由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性,。例如：Keller等測(cè)試人奶中的蛋白,，結(jié)果Lowry，BCA測(cè)出的濃度明顯高于Bradford,，差異顯著,。即使是測(cè)定同一樣品,，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測(cè)試后的濃度也不一致,。如用Lowry測(cè)試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì),，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml,，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,，濃度2.64mg/ml。因此,，在選擇比色法之前,，是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,。另外,，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題是樣品的吸光值太低,，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大,。關(guān)鍵問(wèn)題是，反應(yīng)后的顏色是有一定的半衰期,，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間,，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試,。時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低,。除此,，反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因,。此外,，非常重要的是，是用塑料的比色法,。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯,，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確,。

　　三,、細(xì)菌細(xì)胞密度（OD600）

　　實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度,。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn),，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法,。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液,，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液,。為了保證正確操作，必須針對(duì)每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),，做出校正曲線,。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基,，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后,，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng),。另外,，需要注意的是，測(cè)試的樣品不能離心,，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài),。

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