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分光光度計(jì)就是利用分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器,。由于核酸,，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量樣本量很小,，于是超微量分光光度計(jì)應(yīng)運(yùn)而生,。超微量分光光度計(jì)近年來已經(jīng)替換普通的分光光度計(jì)成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的新寵，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等領(lǐng)域,。

超微量分光光度計(jì)與傳統(tǒng)分光光度計(jì)相比,，前者具備的*優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)所需樣品體積小，僅需0.5—2μl,；

(2)不需要比色皿,，用移液槍直接將樣品滴加到檢測(cè)平臺(tái)上，測(cè)量時(shí)樣品自動(dòng)形成液柱,，檢測(cè)完成后只需用干凈的吸水紙將樣品從檢測(cè)平臺(tái)上擦拭干凈即可,，避免了因?yàn)楸壬笄逑床粌魩淼慕徊嫖廴荆?/span>

(3)一般具有多個(gè)光程(電機(jī)控制自動(dòng)選擇)【BIO-DL MicroDrop基座模式下光程1.0 mm、0.2 mm、0.1 mm 和 0.05 mm自動(dòng)調(diào)整】,，而傳統(tǒng)分光光度計(jì)的光程為10 mm,，超微量分光光度計(jì)樣品無需稀釋，測(cè)量范圍可達(dá)到常規(guī)分光光度計(jì)的50倍【BIO-DL MicroDrop基座模式下dsDNA檢測(cè)范圍：2~15000ng/μl】,；

(4)氙氣閃光燈為燈源,，代替了氘燈(紫外)和鎢燈(可見)，使用壽命更長,；

(5)不需要預(yù)熱,，可隨時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間短【BIO-DL MicroDrop＜5秒】,；

(6)顯示吸光度值的同時(shí),，程序直接給出濃度值(核酸、蛋白和熒光染料),；

(7)占據(jù)實(shí)驗(yàn)室空間體積比傳統(tǒng)分光光度計(jì)小很多【BIO-DL MicroDrop重量：2.1kg】,。

超微量分光光度計(jì)不僅涵蓋了可見光分光光度計(jì)的功能而且也可以進(jìn)行紫外分光光度計(jì)的應(yīng)用，zui常用以下幾方面：

• 核酸的定量

核酸的定量是超微量分光光度計(jì)使用頻率zui高的功能,?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈DNA,、雙鏈DNA,，以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長260nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對(duì)應(yīng)消光因子,。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig,。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。除了核酸濃度,，分光光度計(jì)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,，如A260/A280的比值，用于評(píng)估樣品的純度,，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm,。純凈的樣品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響,。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物,，多肽,，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0,。

• UV-VIS常規(guī)可見-紫外檢測(cè)

全波長超微量分光光度計(jì)可以像普通的紫外-可見分光光度計(jì)一樣行使功能,。如BIO-DL MicroDrop可以顯示從185到910nm的光波下樣品的吸光值。zui多可以同時(shí)檢測(cè)40個(gè)波長下的吸光值并把數(shù)據(jù)顯示在報(bào)告中,。

• 蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)

這種方法是在280nm波長,，直接測(cè)試蛋白。蛋白質(zhì)測(cè)定過程非常簡(jiǎn)單,，先測(cè)試空白液,，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)直接定量方法,，適合測(cè)試較純凈,、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來說,，速度快,，操作簡(jiǎn)單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,，如DNA的干擾,；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高,。

• 比色法蛋白質(zhì)定量

 蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸(如酪氨酸，絲氨酸)與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),，產(chǎn)生有色物質(zhì),。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。

比色方法一般有BCA,，Bradford，Lowry等幾種方法,。

Lowry法：以zui早期的Biuret反應(yīng)為基礎(chǔ),，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng),，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物,。但是與Biuret相比,，Lowry法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑;反應(yīng)需要的時(shí)間較長;容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA,，Tritonx-100,，ammoniasulfate等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

BCA(Bicinchoninineacidassay)法：這是一種較新的,、更敏感的蛋白測(cè)試法,。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生Cu+，后者與BCA形成螯合物,，形成紫色化合物,，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*,，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定,。相對(duì)于Lowry法，操作簡(jiǎn)單,，敏感度高,。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

Bradford法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng),，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm,。其zui大的特點(diǎn)是，敏感度好,，是Lowry和BCA兩種測(cè)試方法的2倍,；操作更簡(jiǎn)單，速度更快,；只需要一種反應(yīng)試劑,；化合物可以穩(wěn)定1小時(shí)，方便結(jié)果,；而且與一系列干擾Lowry,，BCA反應(yīng)的還原劑(如DTT，巰基乙醇)相容,。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的,。zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性,。

• 細(xì)菌細(xì)胞密度(OD600)

實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長密度和生長期,，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長密度,。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn),，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法,。

超微量分光光度計(jì)使用時(shí)注意小貼士：

（1）測(cè)量前將樣品中度混勻（可采用震蕩器或用手指彈震管底）

（2）移液器吸頭插入液面下吸取樣品,，可避免吸入氣泡,；TIP頭貼著下光纖表面打出樣品，且只按到移液器*擋盡頭,，第二擋不要按,，可以避免吹出氣泡到樣品中。

（3）每次測(cè)量完畢后,，用蒸餾水清潔上下光纖端面,，這樣可以更好地保證下一次測(cè)量的準(zhǔn)確性（主要針對(duì)超高濃度樣品，一般樣品無此要求）,。

（4）每次做空白檢測(cè)前一定要先用水清潔上下光纖表面,，可保證空白檢測(cè)準(zhǔn)確。

（5）每次測(cè)量的核酸樣品量建議為1-2微升,蛋白樣品建議2微升,。 過少可能無法形成水柱,，過多可能溢出。

（6）加樣后盡快測(cè)量,，以防蒸發(fā)濃縮以及灰塵落入,，已加樣品不能多次檢測(cè)，如需重測(cè)需重新滴加同一樣品,。

（7）儀器避免陽光直射,，避免強(qiáng)風(fēng)吹拂，以避免蒸發(fā),。

（8）連續(xù)測(cè)量一段時(shí)間后擦凈樣品,，用水清潔上下光纖表面，然后用水或緩沖液進(jìn)行重新空白后再檢測(cè),。

（9）清潔光纖端面（上樣基座）時(shí)必須用潔凈質(zhì)軟的實(shí)驗(yàn)室用紙（擦鏡紙等）進(jìn)行輕輕擦拭,。

（10）儀器不用時(shí)，將上臂放下,，可以防止灰塵,。

※ 超微量分光光度計(jì)新晉小生——MicroDrop簡(jiǎn)介

• 一機(jī)多用：既可使用超微量基座（下圖上），也可使用常規(guī)比色皿（下圖下）,，想怎么測(cè)就怎么測(cè),！

• 開機(jī)即用：交貨后即可使用 – 安裝時(shí)不需要進(jìn)行任何調(diào)節(jié)。只需開啟電源就能進(jìn)行測(cè)量,！

• 上樣量少：上樣范圍0.5μl-2μl,，節(jié)約珍貴的樣本。再也不用擔(dān)心樣品不夠用啦,！

• 無線連接：無需數(shù)據(jù)線連接電腦,，從此告別雜亂的數(shù)據(jù)連接線，儀器可自發(fā)WiFi信號(hào),。

• 全光譜范圍：可檢測(cè)185-910nm波長下樣本的吸光值,，檢測(cè)范圍廣,，基座模式下因?yàn)榭s短了光程，檢測(cè)濃度范圍非常廣闊,，dsDNA:2-15000ng/ul,，無需稀釋樣品，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程,，減少實(shí)驗(yàn)誤差,，能夠滿足極大部分用戶的需求。

• 檢測(cè)快速：全波長掃描時(shí)間（185—910nm）只需5s,，每個(gè)樣品所需要的時(shí)間不到5秒鐘,，快速的檢測(cè)速度為大量的樣品檢測(cè)節(jié)省了寶貴時(shí)間。

• 美觀簡(jiǎn)約：自重2.1kg,，便于移動(dòng),，占地面積小，選配平板無線連接,，平板可隨測(cè)隨取,，節(jié)省實(shí)驗(yàn)臺(tái)面空間。

• 數(shù)據(jù)存儲(chǔ)：可自定義選擇數(shù)據(jù)存儲(chǔ),，不僅能夠自動(dòng)保存檢測(cè)原始數(shù)據(jù),，也可導(dǎo)出Excel數(shù)據(jù)表，方便計(jì)算后續(xù)實(shí)驗(yàn)的加樣量,。