IT4IP核孔膜在誘導(dǎo)脂質(zhì)囊泡膜融合和細(xì)胞內(nèi)遞送的應(yīng)用研究

 

高分子聚合物薄膜經(jīng)高能重離子輻照后,，在薄膜中沿入射離子路徑上會形成圓柱狀損傷區(qū)域,，直徑約１０ｎｍ,，這些損傷區(qū)域稱作離子的潛徑跡,，潛徑跡經(jīng)過化學(xué)蝕刻處理可形成中空通道（孔）,，即為核孔膜,。相比于常規(guī)濾膜,，IT4IP核孔膜擁有眾多優(yōu)點，如表面平整光滑,、孔徑均一,、圓柱形孔形（圖１－１），此外還具有機(jī)械強(qiáng)度高,、過濾速度快和截留特性好等優(yōu)點,。

核孔膜的生產(chǎn)工藝主要包括輻照、紫外敏化和蝕刻等三個主要步驟,。輻照一般利用加速器或者反應(yīng)堆進(jìn)行,，目前主要都采用加速器進(jìn)行輻照。紫外敏化主要是改善核孔膜的孔形,，讓錐度更小,、透氣率更高、孔徑更均勻,?；瘜W(xué)蝕刻則決定核孔膜最終孔徑大小

基于IT4IP核孔膜的特點，其應(yīng)用已相當(dāng)廣泛,。目前,，很多微生物檢測、癌細(xì)胞的檢測以及氣體的檢測都需要用到核孔膜截留取樣,。在制藥工業(yè),，核孔膜主要用于藥用水的過濾及終端除菌過濾,，血液制品的過濾，空氣與蒸汽的過濾等,。在食品飲料行業(yè),，核孔膜用于酒類、飲用水,、奶制品,、茶飲料等的澄清和除菌過濾，可代替離心法用于分離,，或代替熱處理法用于除菌,。在電子工業(yè)，可用于制備光刻膠及環(huán)境氣體凈化,，以提高電子產(chǎn)品的質(zhì)量和成品率,。在化工業(yè)，IT4IP核孔膜用于制備超純試劑及溶劑中貴重的懸浮物和觸媒的回收等,。此外,，在藥用及化妝品用脂質(zhì)體制劑的研發(fā)和生產(chǎn)中，基于核孔膜的擠出法是脂質(zhì)體粒徑均一化及降低粒徑的方法之一,。

本文基于IT4IP核孔膜的擠出法進(jìn)行了兩部分研宄,，一是擠出法誘導(dǎo)脂質(zhì)囊泡膜融合并構(gòu)建雜化外泌體，二是基于擠出法的細(xì)胞內(nèi)遞送研究,。主要內(nèi)容及結(jié)果如下：

１,、擠出法誘導(dǎo)熒光標(biāo)記脂質(zhì)體與空白脂質(zhì)體發(fā)生膜融合。采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法對膜融合過程進(jìn)行了定性和定量分析,，并檢測了膜融合前后脂質(zhì)體粒徑的變化,，以凍融法作為對照。結(jié)果顯示,，經(jīng)過擠出處理,，焚光標(biāo)記脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體發(fā)生了膜融合，也即熒光標(biāo)記磷脂轉(zhuǎn)移到空白脂質(zhì)體,，膜融合效率與凍融法相當(dāng),，且耗時較短。相比凍融法,，所制得的膜融合脂質(zhì)體粒徑均一,。

２、擠出法可誘導(dǎo)熒光標(biāo)記脂質(zhì)體和外泌體發(fā)生膜融合,，即構(gòu)建雜化外泌體,。首先用透射電鏡對從Ｋ５６２培養(yǎng)上清提取的外泌體進(jìn)行了鑒定，然后利用擠出法誘導(dǎo)熒光標(biāo)記脂質(zhì)體與外泌體發(fā)生膜融合,，熒光共振能量轉(zhuǎn)移法對膜融合過程進(jìn)行了定性和定量分析,，并檢測了膜融合前后脂質(zhì)囊泡粒徑的變化,，以凍融法作為對照。結(jié)果顯示,，經(jīng)過擠出處理,，焚光標(biāo)記脂質(zhì)體和外泌體發(fā)生了膜融合，但透射電鏡下雜化外泌體仍然保持了典型的茶托結(jié)構(gòu),。擠出法的膜融合效率稍低于凍融法,，但其具有耗時短的優(yōu)點。此外,，擠出法制備的雜化外泌體具有較均勻的粒徑，而凍融法構(gòu)建的雜化外泌體則粒徑及粒徑分布范圍都變大,。

３,、基于IT4IP核孔膜的擠出法可通過誘導(dǎo)ＣＴ２６細(xì)胞變形及細(xì)胞膜短暫穿孔而將介質(zhì)中各種大分子遞送進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)擠出處理的ＣＴ２６細(xì)胞仍可正常貼壁生長及增殖,。膜孔徑和遞送材料的分子量是影響遞送效率的重要因素,。不同分子量右旋糖酐經(jīng)擠出遞送后，在細(xì)胞漿和細(xì)胞核都有分布,，但是質(zhì)核比與分子量呈正相關(guān),。

４、基于IT4IP核孔膜的擠出法可通過誘導(dǎo)Ｋ５６２細(xì)胞變形及細(xì)胞膜短暫穿孔而將介質(zhì)中各種大分子遞送進(jìn)入細(xì)胞,，經(jīng)擠出處理的Ｋ５６２細(xì)胞任可正常生長及增殖,。膜孔徑和遞送材料分子量是影響遞送效率的重要因素。此外,，不同分子量的右旋糖酐經(jīng)擠出遞送后,，在細(xì)胞漿和細(xì)胞核都有分布，水合半徑大于核膜復(fù)合體被動擴(kuò)散尺度上限的２ＭＤａ右旋糖酐主要在擠出處理后起初的１小時內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞核,，這強(qiáng)烈提示擠出處理誘導(dǎo)了核膜破裂,，從而允許其進(jìn)入細(xì)胞核。