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腺病毒包裝技術(shù)中的Z大難點(diǎn)
閱讀：4155 發(fā)布時(shí)間：2016-1-6
在目前的腺病毒包裝技術(shù)中，一直困擾著技術(shù)人員的一大難點(diǎn)就是如何將外源基因表達(dá)框或者外源的shRNA表達(dá)框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上,，如果是用現(xiàn)在比較常規(guī)的方法即酶切-連接的方式將外源基因或者shRNA表達(dá)框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上來進(jìn)行操作,，往往成功率比較低，原因在于：我們知道,，腺病毒骨架載體比較大（~30kb）,，而且載體中的一些常用酶切位點(diǎn)幾乎都有多個，這就造成了低成功率的現(xiàn)象,。為此,，我們需要采用另外一種方法對其進(jìn)行包裝即用同源重組的方法將外源基因或shRNA表達(dá)框構(gòu)建至腺病毒骨架載體上。
重組腺病毒的包裝制備：重組腺病毒是從由侵染色斑組成單位（pfu）中分離獲得的,。一個單色斑是線性載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后在20×15 cm板上由293A細(xì)胞連續(xù)侵染后被挑選和擴(kuò)增形成的,。重組腺病毒可通過超速離心純化，并測定滴度及進(jìn)行PCR鑒定,。純化后重組腺病毒的滴定濃度為1010pfu/ml,，獲得的量為2-4 ml,。
作為現(xiàn)在比較可靠的重組病毒表達(dá)系統(tǒng)，腺病毒可用于哺乳細(xì)胞中瞬時(shí)及高水平地表達(dá)shRNA或目的蛋白,，并具有以下優(yōu)勢：
1,、腺病毒可感染一系列哺乳動物細(xì)胞，除可感染幾乎所有人的細(xì)胞類型外,，還可感染包括大鼠,、小鼠、兔,、豬,、羊、猴,、雞等物種,。
2、因腺病毒的感染不依賴細(xì)胞周期,，故其既可以感染增殖細(xì)胞也可以感染非增殖細(xì)胞,，且病毒滴度高，可用于動物水平的實(shí)驗(yàn),。
3,、腺病毒具有嗜上皮細(xì)胞特性，因大多數(shù)腫瘤細(xì)胞均屬于上皮細(xì)胞,，這使得腺病毒非常適合應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域,。
4、有較好的生物安全性,。腺病毒攜帶的基因不會整合到宿主細(xì)胞基因組中,；實(shí)驗(yàn)中雖然會有一定機(jī)率出現(xiàn)RCA（即復(fù)制型腺病毒），但由于大多數(shù)成人體內(nèi)都有針對腺病毒的抗體,，所以一般危害不大,。
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