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如何完成western blot檢測實驗報告
閱讀：3653 發(fā)布時間：2015-11-18
本公司可為您提供專業(yè)的western blot檢測服務，歡迎有需要的客戶前來咨詢,。
western blot檢測服務（蛋白印跡雜交）,，又稱免疫印跡(immunoblotting)，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一,，主要利用抗原抗體反應,，目前該技術已經發(fā)展的十分成熟,，大多數實驗室都已具備western blot檢測的能力，但是如果想要得到一份真實客觀,。條理清晰的實驗結果就需要我們花很大功夫,，下面小編就為大家詳細介紹一下關于western blot檢測服務實驗報告的一些操作。
1,、蛋白質抽提
1）實驗對象為組織樣品,，取適量（250-500mg）新鮮組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）,，勻漿后抽提總蛋白,。
2）實驗對象為細胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細胞,，PBS清洗細胞,，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白。
2,、蛋白質定量：按KCTMBCA蛋白質定量試劑盒操作說明操作,，測定樣品濃度。
3,、變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE)：將準備好的樣品液和生物素標記的蛋白質分子量標準分別上樣,，標準加進*個孔中，電泳分離蛋白,。
4,、蛋白質轉移到硝酸纖維膜或PVDF膜
5、膜的封閉和抗體孵育
1）膜在5％BSA溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結合,。
2）封閉過的膜加入一級抗體室溫孵育1.5小時，抗原抗體結合,。
3）加入HRP標記的二級抗體以結合一級抗體及HRP標記的抗生物素抗體以結合分子量標準,，室溫孵育膜1小時。加入HRP標記的GAPDH抗體可同時檢測GAPDH含量,。
6,、結果檢測：化學發(fā)光法檢測，膜與化學發(fā)光底物孵育,，經X膠片曝光顯影,。圖片掃描保存為電腦文件，并用ImageJ分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數字化,。
7,、數據分析：目的蛋白的灰度值除以內參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量,。
8,、提供實驗報告：包括詳細的實驗方法及Western Blot實驗結果,。