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簡述DNA甲基化檢測
閱讀：4800 發(fā)布時間：2013-11-22DNA甲基化是哺乳類動物一個重要的基因外遺傳信號,。有研究表明,DNA甲基化與大多數(shù)腫瘤的發(fā)生相關(guān),抑癌基因啟動子CpG島的高度甲基化可引起抑癌基因表達沉默，細胞出現(xiàn)無節(jié)制生長,導致腫瘤的發(fā)生,。目前,，基因的甲基化研究主要結(jié)合亞硫酸氫鈉處理和PCR技術(shù),，分為甲基化特異性PCR（Methylation specific PCR,MSP）和硫化測序PCR（Bisulfite sequencing PCR, BSP）。
雙鏈DNA變性解鏈后,，在HSO3-作用下發(fā)生C→U轉(zhuǎn)化,，C若已有甲基化則無此改變；甲基化修飾只發(fā)生于5′→3′方向C-G相聯(lián)結(jié)構(gòu)的C上,，因此在HSO3-作用后,，DNA CpG島若無甲基化，則序列中的改變?yōu)镃→U,，CG→UG,，若有甲基化則為C→U，CG→CG,，用不同的引物做PCR,，即可檢測出這種差異，從而確定基因有無CpG島甲基化,。從理論上說,，DNA發(fā)生甲基化的MSP產(chǎn)物的序列與原序列比較，變化為C→T,，CG→CG,，相應(yīng)其互補鏈的改變?yōu)镚→A，CG→CG,。然后設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物并進行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增,，zui后通過瓊脂糖凝膠電泳分析，確定與引物互補的DNA序列的甲基化狀態(tài),。MSP法靈敏度較高,，應(yīng)用范圍廣。
結(jié)合重亞硫酸鹽的測序法是一種靈敏的能直接檢測分析基因組DNA甲基化模式的方法,。重亞硫酸鹽處理后,，用針對改變后的DNA序列設(shè)計特異性引物并進行聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）,。 PCR產(chǎn)物中原先非甲基化的胞嘧啶位點被胸腺嘧啶所替代,，而甲基化的胞嘧啶位點保持不變。PCR產(chǎn)物克隆后進行測序,。通過這個方法能得到特定位點在各個基因組DNA分子中的甲基化狀態(tài),。
1） 根據(jù)目的基因啟動子序列設(shè)計相應(yīng)引物；
2） 基因組DNA的提取和定量,；
3） 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA,；
4） 修飾后DNA純化回收；
5） a,、結(jié)合實時定量PCR的qMSP,；
b,、BSP，對PCR產(chǎn)物進行測序并與未經(jīng)處理的序列比較,；
6） 數(shù)據(jù)處理,；
7） 向客戶提交數(shù)據(jù)分析結(jié)果與實驗報告。
樣品要求：
盡可能新鮮和足量的組織（≥50mg）,、細胞樣品（≥106）或全血（≥300μl）,，或直接提供純化好的DNA（≥5μg/樣品）。
甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）提供甲基,，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環(huán)的五號碳原子上加上甲基的共價修飾過程.
DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式,，它不改變DNA的一級結(jié)構(gòu)，卻在細胞的發(fā)育,、基因的表達,、及基因組的穩(wěn)定性中起著重要的作用。
CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象,，而啟動子CpG 島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機制,。
因此，基因啟動子甲基化檢測在臨床診斷（如甲基化檢測與低劑量CT相結(jié)合）,、藥物敏感性檢測等方面具有很高的應(yīng)用價值,。
目前甲基化特異性PCR（Methylmion Specific PCR，MSP）及其改進方法是檢測基因甲基化的經(jīng)典方法．MSP法的原理是首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA,，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶都被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,，而甲基化的胞嘧啶則不變。然后設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物并進行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增,，zui后通過瓊脂糖凝膠電泳分析,，確定與引物互補的DNA序列的甲基化狀態(tài)。