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慢病毒包裝概述及步驟
閱讀：6894 發(fā)布時間：2013-11-19目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達 RNAi 的研究中,。
由于有些類型細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的 siRNA 半衰期短,，體外合成 siRNA 對基因表達的抑制作用通常是短暫的,，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達 siRNA 的載體,，然后轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄 siRNA 的策略,，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細胞種類增加,，而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成 siRNA ，在長期穩(wěn)定表達載體的細胞中,，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達的作用,。在所構(gòu)建的 siRNA 表達載體中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ啟動子來指導(dǎo) RNA 合成的,，這是因為 RNA 聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列,，而且合成的 RNA 不會帶 poly A 尾。當(dāng) RNA 聚合酶Ⅲ遇到連續(xù) 4 個或 5 個 T 時,，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會停止,，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 3' 端形成 1~4 個U 。 U6 和 H1 RNA 啟動子是兩種 RNA 聚合酶Ⅲ依賴的啟動子,，其特點是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游,，適合于表達～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 莖環(huán)結(jié)構(gòu)（ stem loop ）。在 siRNA 表達載體中,，構(gòu)成 siRNA 的正義與反義鏈,，可由各自的啟動子分別轉(zhuǎn)錄，然后兩條鏈互補結(jié)合形成 siRNA ,；也可由載體直接表達小發(fā)卡狀 RNA（small hairpin RNA, shRNA）,，載體包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ啟動子和 4 ～ 5 T轉(zhuǎn)錄終止位點之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有 1~4 個 U 3 ' 突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu),，在細胞內(nèi)進一步加工成 siRNA ,。構(gòu)建載體前通常要通過合成 siRNA 的方法，尋找的 siRNA ,，然后從中挑選符合載體要求的序列,，將其引入 siRNA 表達載體。
慢病毒載體（ Lentiviral vector ）較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍,，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細胞,。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達 shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞,、干細胞,、受精卵以及分化的后代細胞中表達 shRNA ,，實現(xiàn)在多種類型的細胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達的功能性沉默,，為在原代的人和動物細胞組織中快速而地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達降低的動物提供了可能性,。
慢病毒表達載體包含了包裝,、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息,。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝 RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白,。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞,，在細胞中進行病毒的包裝,，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后,，可以直接用于宿主細胞的感染,，目的基因進入到宿主細胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄,，整合到基因組,，從而高水平的表達效應(yīng)分子。
1. 對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞,，如原代細胞,、干細胞、不分化的細胞等,，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，這就為 RNAi,，cDNA 克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑,。
2. 進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選；
3. 為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液,；
在細胞相關(guān)的實驗操作中,，對于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細胞，通過病毒介導(dǎo)的實驗?zāi)軌虼蟠筇岣呋虻霓D(zhuǎn)導(dǎo)效率,，以達到目的基因的瞬時表達,。
以六孔板中的1孔為例，每個樣品需要1×106個293T細胞,。
1,、取1.5ml滅菌EP管，加入1.5μg包裝混合質(zhì)粒和0.5μg表達質(zhì)粒以及250μl的無血清培養(yǎng)基,。輕柔混勻,，室溫孵育5min。
2,、取1.5ml滅菌EP管,，取9μl 脂質(zhì)體2000l溶于250μl無血清培養(yǎng)基中。輕柔混勻,，室溫孵育5min,。
3、將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液輕柔混勻,。室溫孵育20min
4,、用胰酶消化并記數(shù)293T細胞,。用含血清的培養(yǎng)基重懸細胞。
5,、在六孔板中每孔,，加入1ml含血清的生長培養(yǎng)基，再加入DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物,。
6,、將1ml重懸的293T細胞（1×106個細胞/ml）加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育一晚,。
7,、移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基移除，代之以DMEM（含丙酮酸鈉和非必須氨基酸）,。
8,、轉(zhuǎn)染后48-72h收獲含病毒的上清。3000 rpm 離心20min,，去除沉淀,。
9、病毒上清-80°C貯存,。
包裝出來的慢病毒對NIH/3T3細胞達90%以上感染效率,。
注意事項：
1.在慢病毒感染細胞前，為檢測病毒上清培養(yǎng)液內(nèi)病毒的活性,，并確定病毒與轉(zhuǎn)染細胞之間的比率,，需要確定病毒的滴度。病毒的滴度可以通過轉(zhuǎn)染Hela細胞,，然后使用抗體篩選穩(wěn)定的細胞轉(zhuǎn)染株,，進行計數(shù)和數(shù)值統(tǒng)計。
2. 在慢病毒轉(zhuǎn)染細胞的過程中zui重要的一步是融合,，只有一些較小的慢病毒載體才能轉(zhuǎn)導(dǎo)進細胞,，因此，病毒顆粒的吸附是慢病毒轉(zhuǎn)染的限速步驟,。