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熒光顯微鏡的工作原理

閱讀:2470      發(fā)布時(shí)間:2020-12-30
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光源
多用采200W的超高壓汞燈作光源,,它是用石英玻璃制作,中間呈球形,,內(nèi)充一定數(shù)量的汞,,工作時(shí)由兩個電極間放電,引起水銀蒸發(fā),,球內(nèi)氣壓迅速升高,,當(dāng)水銀*蒸發(fā)時(shí),可達(dá)50~70個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力,,這一過程一般約需5~15min,。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光,,足以激發(fā)各類熒光物質(zhì),,因此,為熒光顯微鏡普遍采用,。
燈室必須有良好的散熱條件,,工作環(huán)境溫度不宜太高。新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃,,使用一些時(shí)間后,,則需要高壓啟動(約為15000V),啟動后,,維持工作電壓一般為50~60V,,工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命,,在每次使用2h的情況下約為200h,,開動一次工作時(shí)間愈短,則壽命愈短,,如開一次只工作20min,,則壽命降低50%。因此,,使用時(shí)盡量減少啟動次數(shù),。燈泡在使用過程中,其光效是逐漸降低的,。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動,。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉,以免水銀蒸發(fā)不*而損壞電極,,一般需要等15min,。由于超高壓汞燈壓力很高,,紫外線強(qiáng)烈,因此燈泡必須置燈室中方可點(diǎn)燃,,以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸,。
超高壓汞燈(100W或200W)光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流,、啟動幾個部分,。在燈室上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng),燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡,,前面安裝有集光透鏡,。

濾色系統(tǒng)

濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位,由激發(fā)濾板和壓制濾板組成,。濾板型號,,各廠家名稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名,,前面字母代表色調(diào),,后面字母代表玻璃,數(shù)字代表型號特點(diǎn),。
1.激發(fā)濾板 根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn),,可選用以下三類激發(fā)濾板,提供一定波長范圍的激發(fā)光,。
紫外光激發(fā)濾板:此濾板可使400nm以下的紫外光透過,,阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5,,外加一塊BG-38,,以除去紅色尾波。
紫外藍(lán)光激發(fā)濾板:此濾板可使300~450nm范圍內(nèi)的光通過,。常用型號為ZB-2或ZB-3,,外加BG-38。
紫藍(lán)光激發(fā)濾板:它可使350~490nm的光通過,。常用型號為QB24(BG12),。
開始采用金屬膜干涉濾板,由于針對性強(qiáng),,波長適當(dāng),,因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITCKP490濾板和羅達(dá)明的S546綠色濾板,,均比玻璃濾板效果好,。
激發(fā)濾板分薄厚兩種,一般暗視野選用薄濾板,亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些,。
2.壓制濾板 壓制濾板的作用是*阻擋激發(fā)光通過,,提供相應(yīng)波長范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對應(yīng),,常用以下3種壓制濾板:
紫外光壓制濾板:可通過可見光,、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合,。常用GG-3K430或GG-6K460,。
紫藍(lán)光壓制濾板:能通過510nm以上波長的光(綠到紅),能與BG-12組合,。通常用OG-4K510或OG-1K530。
紫外紫光壓制濾板:能通過460nm以上波長的光(藍(lán)到紅),,可與BG-3組合,,常用OG-11K470AK 490,K510,。

反光鏡

其反光層一般是鍍鋁的,,因?yàn)殇X對紫外光和可見光的藍(lán)紫區(qū)吸收少,反射達(dá)90%以上,,而銀的反射只有70%,;一般使用平面反光鏡。

聚光鏡

專為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成,。分明視野聚光器和暗視野聚光器兩種,。還有相差熒光聚光器。
1.明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器,,它具有聚光力強(qiáng),,使用方便,特別適于低,、中倍放大的標(biāo)本觀察,。
2.暗視野聚光器 暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛。因?yàn)榧ぐl(fā)光不直接進(jìn)入物鏡,,因而除散射光外,,激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡,可以使用薄的激發(fā)濾板,,增強(qiáng)激發(fā)光的強(qiáng)度,,壓制濾板也可以很薄,因紫外光激發(fā)時(shí),,可用無色濾板(不透過紫外)而仍然產(chǎn)生黑暗的背景,。從而增強(qiáng)了熒光圖像的亮度和反襯度,提高了圖像的質(zhì)量,觀察舒適,,可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒,。
3.相差熒光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用,可同時(shí)進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀察,,既能看到熒光圖像,,又能看到相差圖像,有助于熒光的定位準(zhǔn)確,。一般熒光觀察很少需要這種聚光器,。

物鏡

各種物鏡均可應(yīng)用。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比,,而與其放大倍數(shù)成反比,,所以為了提高熒光圖像的亮度,應(yīng)使用鏡口率大的物鏡,。尤其在高倍放大 時(shí)其影響非常明顯,。因此對熒光不夠強(qiáng)的標(biāo)本,應(yīng)使用鏡口率大的物鏡,,配合以盡可能低的目鏡(4×,5×,,6.3×等)。

目鏡

在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡,,如5×和6.3×,。過去多用單筒目鏡,因?yàn)槠淞炼缺入p筒目鏡高一倍以上,,但研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡,,觀察很方便。

落射光裝置

新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后,,波長短的部分(紫外和紫藍(lán))由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射,,當(dāng)濾鏡對向光源呈45。傾斜時(shí),,則垂直射向物鏡,,經(jīng)物鏡射向標(biāo)本,使標(biāo)本受到激發(fā),,這時(shí)物鏡直接起聚光器的作用,。同時(shí),濾長長的部分(綠,、黃,、紅等),對濾鏡是可透的,,因此,,不向物鏡方向反射,,濾鏡起了激發(fā)濾板作用,由于標(biāo)本的熒光處在可見光長波區(qū),,可透過濾鏡而到達(dá)目鏡觀察,,熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高,在高放大時(shí)比透射光源強(qiáng),。它除具有透射式光源的功能外,,更適用于不透明及半透明標(biāo)本,如厚片,、濾膜,、菌落、組織培養(yǎng)標(biāo)本等的直接觀察,。

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