介紹
01
為加快糧食產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展，推進糧食產(chǎn)業(yè)供給和結構性質(zhì)改革,，國家糧食局推出“優(yōu)質(zhì)糧食工程",，并開展“中國好糧食"行動。?？萍瘓F積極響應政策的同時,，憑借豐富的實驗室經(jīng)驗，針對相關政策標準制定了系列解決方案,，并將各種自動化設備應用于前處理過程,，盡可能地幫助實驗員提高工作效率，保證糧油產(chǎn)品檢測的準確性,。
值此世界糧食日（2021年10月16日）來臨之際,，我們分享用Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀分析糧油中玉米赤霉烯酮的解決方案。試樣經(jīng)過90%乙腈水溶液提取,，提取液經(jīng)離心,、稀釋后用含有玉米赤霉烯酮特異抗體的免疫親和柱自動凈化。用5 mL水淋洗柱子將免疫親和柱上的雜質(zhì)除去,，以甲醇洗脫免疫親和柱,。將洗脫液在55°C條件下氮吹干，用1 mL初始流動相定容,，經(jīng)高效液相色譜儀上機分析,。
圖-1玉米赤霉烯酮結構式
本應用文章參考GB5009.209-2016《食品中玉米赤霉烯酮的測定》第一法，采用免疫親和柱凈化,，高效液相色譜檢測,，建立了復雜糧油樣品基質(zhì)中玉米赤霉烯酮高靈敏度的前處理和分析方法，得到四種常見糧油基質(zhì)中玉米赤霉烯酮的加標回收率在88.0%-112.0%之間,，RSD值小于5%,。
儀器與耗材
02
Auto Prep 200全自動液體樣品處理工作站；Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀 ；
Auto EVA 80 全自動平行濃縮儀,；
玉米赤霉烯酮免疫親和柱 (Romer，1500ng/3mL),；
高效液相色譜: Waters ACQUITY UPLC I-Class配備大體積流通池,；
甲醇（Merck，色譜純）,；乙腈（Merck,，色譜純）；吐溫-20（Sigma,，試劑純）,；超純水（Waston）；
PBS鹽包
配標
凈化
濃縮
標準曲線配制
03
使用Auto Prep 200全自動液體樣品處理工作站可實現(xiàn)標準品的全自動化配制,，將單標母液(1000 mg/L)通過工作站的直接稀釋模式,，配制成濃度為10 mg/L的工作中間液，緊接著可通過程序設置,，吸取該工作液,，配制一條濃度分別為0.01 mg/L，0.02 mg/L,，0.1 mg/L,，0.2 mg/L和0.5 mg/L的標準工作曲線。
圖-2. Auto Prep 200 液體工作站配標程序
樣品提取與前處理
04
大米,、玉米,、小麥樣品
準確稱取5 g粉碎過的樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水溶液(9:1)(v/v),，渦旋震蕩提取20 min,，以7000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min；取5 mL上清液于試管中,，加入20 mL 0.1%吐溫-20的PBS緩沖液混勻,，以7000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取10 mL上清液于80 mL上樣管中,，待用,。
玉米油樣品
準確稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水溶液(9:1)(v/v),，渦旋震蕩提取20 min,，以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min；余下步驟同上,。
固相萃取凈化條件
全自動固相萃取儀 | Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀 |
固相萃取柱 | 玉米赤霉烯酮免疫親柱 (1500ng/3mL) |
淋洗 | 超純水 |
洗脫 | 甲醇 |
表-1 固相萃取凈化條件
以2 mL/min的速度精確上樣10 mL待測液,，5 mL水清洗樣品瓶，5 mL水淋洗免疫親和柱，氣推30 mL吹干免疫親和柱,，推速為80 mL/min,。最后用2 mL甲醇以0.5mL/min的速度洗脫樣品，收集洗脫液用Auto EVA 80 全自動平行濃縮儀于55°C,、1 L/min條件下吹干,，用初始流動相定容至1 mL，過濾膜上機分析,。詳細步驟見圖-3,。
圖-3. Fotector Plus 玉米赤霉烯酮免疫親和柱凈化方法
檢測條件
05
色譜柱 | Waters BEH-C18(2.1×100 mm,1.7 um) |
流速 | 0.200 mL/min |
流動相 | 水:甲醇:乙腈=46:8:46 |
柱溫 | 35°C |
進樣體積 | 10 μL |
梯度洗脫 | 等度洗脫 |
熒光檢測器 | 激發(fā)波長303nm，發(fā)射波長440nm |
表-2 玉米赤霉烯酮液相色譜檢測條件
樣品測試
06
分別取大米,、玉米,、小麥樣品各5g，添加20 ug/kg的玉米赤霉烯酮標準品,，進行上述步驟的前處理凈化,。
取空白玉米油樣品5 g，添加20 ug/kg的玉米赤霉烯酮標準品,，進行上述步驟的前處理凈化,。
樣品回收率如下表-3所示：
表-3添加水平為20 ug/kg樣品回收率結果
結果與討論
07
1.樣品提取液pH對回收率的影響
只用純水稀釋樣品提取液進行上述凈化步驟，樣品中的加標回收率只有71-78%,；若采用0.1%吐溫-20的PBS緩沖液進行樣品提取液稀釋,，樣品回收率為88-112%。
2.洗脫速度的影響
采用1 mL/min的洗脫速度,，洗脫效果不佳,，回收率在72%-81%；降低洗脫速度至0.5 mL/min,，洗脫效果有明顯提升,，回收率在88-112%。因此洗脫速度不宜設置得過快,。
3.乙腈提取液用PBS緩沖液稀釋后容易變渾濁,，用濾紙過濾混合液效果不佳，因此建議采用高速離心的方式使混合液變澄清以利于后續(xù)的過柱,。
4.谷物中離心完成后,，不可放置過長時間，否則谷物容易重新吸水,，可能導致提取液的濃度過高,，使樣品的回收率偏高，影響測試結果,。
5.固相萃取進行提取液凈化前,，特別對于偏酸或偏堿性樣品，應用PBS緩沖溶液（pH=7.4）進行稀釋后上機，否則可能會導致回收率偏低,。
總結
1. 采用高通量全自動固相萃取儀法,，準確性、重復性,、再現(xiàn)性均滿足符合GB 5009.209-2016 要求,。
2. 采用Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀對樣品進行檢測能同步進行6個樣品凈化，連續(xù)自動處理60個樣品,，做樣通量高；同時可無人值守,，提高了工作效率,。此外還可避免工作人員因操作失誤導致的檢測偏差。
3. ?？?Auto Prep 200全自動液體工作站可實現(xiàn)混標,、標準曲線的自動配制，全程無需人為值守,，讓實驗人員遠離有毒有害的化學物質(zhì),。
4. 睿科Auto EVA 80 全自動平行濃縮儀處理通量高,，80個樣品可同時進行氮吹,，實驗平行性好；采用氮吹針自動追隨液面的設計,，無需手動調(diào)節(jié)氮吹針且耗氣量小,，省時省力。
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