PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit

PKH26紅色熒光細胞鏈接試劑盒

PKH26 紅色熒光細胞鏈接試劑盒PKH26 紅色熒光細胞鏈接試劑盒

產品簡介
    PKH26是一種磚利的膜標記探針,結構上帶有-長脂肪族尾巴,，能穩(wěn)定插入細胞膜脂質區(qū)域,。PKH26熒光處于黃橙色光譜區(qū)間(見圖1) , *大激發(fā)波長為551nm,*大發(fā)射波長是567nm ,與羅丹明或PE檢測系統兼容,。也可能用標準熒光素( Fluorescein)激發(fā)濾片,但熒光強度可能會有些降低,。PKH26具 *長的體內半衰期,，超過100天。

本產品PKH26熒光細胞連接試劑盒采用擁有磚利的膜標記技術,，磚利膜標記技術,，穩(wěn)定的與細胞膜脂質區(qū)結合并發(fā)出紅色熒光，染色方式依賴于細胞與膜的類型,，主要用于細胞體外標記,、體外細胞增殖研究及體內外細胞示示蹤研究。

 產品組成

自備材料

1,、充分分散的單個細胞懸液

2,、含血清的組織培養(yǎng)基（*培養(yǎng)基）

3、無Ca2+,，Mg2+和血清的培養(yǎng)基或者緩沖鹽（如Dulbecco’s PBS或Hank’s BSS）

4,、血清，白蛋白或其它組織兼容性蛋白

5,、離心管（4-15mL）

6,、溫控離心機（1,000×g）

7、熒光分析設備（熒光讀板機,，熒光或共聚焦顯微鏡,，流式細胞儀）

8、層流罩

9,、血球計數板或細胞計數器

10,、載玻片和蓋玻片

操作方法（下列過程*終體積為2mL，含2uM PKH26,，以及1×107cells/mL細胞濃度）

（以下過程均在室溫下進行（20-25℃）
1. 將2×107個細胞于離心管中,，用不含血清培養(yǎng)基洗一遍。

【注意】血清蛋白和脂質會與染料結合,，降低與細胞膜結合的染料濃度,。*好在用稀釋液C重懸細胞染色前（第四步）用無血清培養(yǎng)基或緩沖液洗細胞一次（**步）,。

2. 400×g離心5分鐘?！咀⒁狻縋KH26染料不能直接加到離心沉淀中，這樣會造成細胞染色不均一和細胞活力降低,。

3. 離心后,，小心吸棄上層清液，剩余上層細 胞液體積不超過25μL,。

【注意】為得到可重復的實驗結果,，在用稀釋液C重懸時，減少殘留培養(yǎng)基或緩沖液體積非常重要,。

4.加入1mL稀釋液C用移液管輕輕吹打混勻,，制備  2×細胞懸液。不要用振蕩器震蕩,，不要讓 細胞在稀釋液C中保存太長時間,。

【注意】生理鹽（physiologic salts）的存在會使得染料結團并大幅降低染色效率。因此,，需確保染色時細胞懸浮于稀釋液C中,，不含培養(yǎng)基或緩沖鹽。

5.臨染色之前,，將4μL PKH26乙醇溶液加 入1mL稀釋液C中,，充分混勻，配制的  2×染色液（4×10-6M）,。

【注意①】：為減少乙醇對細胞活率的影響,，步驟5加入的染料使得步驟6中乙醇*終濃度不能超過1-2%。

【注意②】：如果所需染料*終濃度＜2×10-6M,，需用100%乙醇將PKH26稀釋于另一單獨的容器中,，以確保實驗結果的可重復性。

6. 快速將1mL 2×細胞懸液（步驟4）加入  1mL 2×染色液（步驟5）中,，立即用移液 管混勻,。*終細胞濃度為1×107/mL，PKH26濃度為2×10-6M,。

【注意】：由于染色瞬間完成,，快速將細胞與染料混勻對得到明亮、均勻和可重復的標記結果非常重要,。下列措施有助于得到較優(yōu)的結果：

a.不要將PKH26染料直接加入含2×細胞的稀釋液C中,。

b.將2×細胞懸液（步驟4）與2×染色液（步驟5）等體積混合。

c.調整2×細胞和2×染料的濃度避免染色 體積太?。ǎ?00μL）或太大（＞5mL）,。

d.用電動移液器快速將細胞和染料混勻,。 血清移液管混勻速度太慢而使得染色不 均勻。Racking和旋渦震蕩混勻同樣混勻 較慢,，染色均一性較差,。

e.分配體積盡量準確，以保證樣品與樣品 之間,，實驗與實驗之間的可重復性,。

7.混勻后的染色的細胞孵育1-5 min。由于 染色速度較快,，延長孵育時間對實驗沒有幫助,。

【注意】：讓細胞在染色液中停留盡量短的時間，同時保證得到理想的染色強度,。因為稀釋液C缺少生理性鹽,，過長時間的暴露在稀釋液C中會造成某些細胞活力降低。如果不能確定其影響程度,，可增加僅作稀釋的對照組和只用乙醇而不用染料染色的對照組,。

8. 加入等體積的血清（2mL）或其它合適的蛋白溶液（如1% BSA）終止反應，孵育1min以結合多余的染料,。

【注意①】：血清（或等效的蛋白濃度）為*優(yōu)的終止液,。如果用*培養(yǎng)基替代，添加體積為10mL,。

【注意②】：不要通過加稀釋液C或離心來終止反應,。

【注意③】：不要用無血清培養(yǎng)基或緩沖鹽，他們會使染料產生聚集,。染料聚集使清洗過程中無法洗凈,，使得分析過程中仍存在未標記的細胞。

9.將細胞在20-25℃條件下400×g離心10min,，小心吸棄上清,。用10mL*培養(yǎng)基重懸，將重懸液轉移至另一新的無菌離 心管中,，20-25℃條件下400×g離心5 min,。用10mL*培養(yǎng)基再清洗兩遍以除去沒 結合的染料。

【注意①】：將重懸液轉移至新離心管中,，減少了離心管壁殘留的染料對洗滌效率的影響,；

【注意②】：不要用稀釋液C清洗。

10. *后一步清洗后,，用10mL*培養(yǎng)基重懸細胞評估細胞回收率,，細胞活率和熒 光強度（圖2。離心重懸細胞至所需活細 胞濃度,。

【注意①】：染色后的細胞可以用中性甲醛固定,，避光條件下,，熒光強度至少3周內保持穩(wěn)定。

【注意②】：染色熒光強度一般為背景的100-1000倍,。雖然染色的CV值與細胞種類有關,，但熒光分布應該盡量均勻對稱。

11,、MC-38 TIL細胞用上述PKH26濃度染色,，*終細胞濃度為1×107/ml?；盍Γā┯蒄ITC染色測定,，平均熒光強度（●）用流式細胞儀檢測,。用20μM PKH26標記后,，抗腫瘤TIL特異性和效能沒有改變。

 運輸和保存方法

冰袋運輸,。2-8℃保存,，有效期1年。PKH26乙醇溶液冷藏保存,。保證染料乙醇溶液瓶蓋蓋緊減少蒸發(fā)以防止染料濃度升高,。

 注意事項

1、親脂性染料結合到細胞膜上完成標記,。染色強度是染料濃度和細胞濃度的函數,，與滲透性無關。因此,，保證染料添加量不過量非常關鍵,。過標記的細胞將會導致細胞膜完整性缺失或降低細胞活性。

2,、本品可用于體內體外細胞的標記,，包括干細胞、**細胞,、單核細胞,、內皮細胞、神經細胞或者任何其他細胞,。體內細胞的標記過程需一定的改進,，如血小板的染色，或者選擇性標記吞噬細胞,。

3,、本品染色過程中細胞濃度和染料濃度代表操作的起始濃度。該濃度被證明適用于多種細胞,。使用者需通過評估染色后細胞活率（如,，PI染色）,、熒光強度、染色均勻度及是否對所研究細胞功能有影響等,，根據實驗目的,，確定*優(yōu)的染料濃度和細胞濃度。

4,、雖然貼壁細胞也可以染色,，但單個懸浮細胞染色均一性更佳。因此用蛋白酶（trypsin/EDTA）將貼壁細胞消化成單個懸浮細胞后再染色效果更佳,。

5,、PKH26染色過程中，不能存在疊氮化物或代謝毒性物,。

6,、熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光,，以減緩熒光淬滅,。

7、該染料避光保存,，使用前觀察是否有結晶,。如出現結晶，室溫防止30min,，然后超聲或震蕩直至溶解,。

8、稀釋液C可室溫或冷藏保存,。如果冷藏保存,，使用前復溫至室溫。稀釋液C為無菌溶液,，不含任何防腐劑和***,，其需保持無菌。不要將染料儲存于稀釋液C中,。溶于稀釋液C的工作液需現配現用,，且配好后需立即使用。