嘌呤霉素鹽酸鹽（抗生素）

產(chǎn)品簡介：

產(chǎn)品應(yīng)用：   

    嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑鏈霉菌（Streptomyces alboniger）發(fā)酵代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素,，通過抑制蛋白質(zhì)合成而殺死革蘭氏陽性菌及各類動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞。某種特殊情況下有效作用大腸桿菌,。其作用機(jī)制：嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的類似物,，能夠與核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中。同A位點(diǎn)結(jié)合后,，不會(huì)參與隨后的任何反應(yīng),，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。嘌呤霉素產(chǎn)生菌Streptomyces alboniger內(nèi)發(fā)現(xiàn)的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAC）,，賦予機(jī)體對(duì)嘌呤霉素產(chǎn)生抗性,。這一特性如今普遍應(yīng)用于篩選特定攜帶pac基因質(zhì)粒的哺乳動(dòng)物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。嘌呤霉素在細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選中的普遍應(yīng)用與慢病毒載體的特性有關(guān),，現(xiàn)在商業(yè)化的慢病毒載體多數(shù)都攜帶pac基因,。在某些特定情況下，嘌呤霉素亦可以用來篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株,。

產(chǎn)品屬性：

CAS號(hào)（CAS NO.）：58-58-2

分子式（Formula）：C₂₂H₂₉N₇O₅·2HCl

分子量（Molecular weight）：544.43

純度（Purity, HPLC）：＞98%

外觀（Appearance）：白色至米白色粉末

化學(xué)結(jié)構(gòu)式（Structure）：

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸,。4℃干燥保存，1年有效,；為了維持產(chǎn)品穩(wěn)定性,，建議-20℃干燥保存，2年有效,。

使用方法

1. 建議使用濃度

哺乳動(dòng)物細(xì)胞：1-10μg/mL,，濃度需要?dú)缜€來確定。

大腸桿菌：LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌,，使用濃度為125μg/mL,。

注：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié)，而且受宿主細(xì)胞本身的影響,。

2. 溶解方法

用蒸餾水溶解嘌呤霉素配制成50mg/mL母液,，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后分裝，-20℃凍存；也可溶于甲醇,，配制成10mg/mL儲(chǔ)存液,。

3. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定（以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)為例）

嘌呤霉素有效篩選濃度跟細(xì)胞類型、生長狀態(tài),、細(xì)胞密度,、細(xì)胞代謝情況及細(xì)胞所處細(xì)胞周期位置等有關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的shRNA細(xì)胞株,，確定殺死未轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的zui低濃度嘌呤霉素至關(guān)重要,。建議初次做實(shí)驗(yàn)的客戶一定要建立適合自身實(shí)驗(yàn)體系的殺死曲線（kill curve）。

1） Day 1：24孔板內(nèi)以5~8 × 10⁴ cells/孔的密度鋪板,，鋪?zhàn)銐蛄康目滓赃M(jìn)行后續(xù)的梯度實(shí)驗(yàn),。37℃細(xì)胞孵育過夜。

2） Day 2：a）準(zhǔn)備篩選培養(yǎng)基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基（如0-15μg/mL,，至少5個(gè)梯度）,；b）往孵育過夜后的細(xì)胞內(nèi)更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基；之后37℃孵育細(xì)胞,。

3） Day 4：更換新鮮的篩選培養(yǎng)基,，并觀察細(xì)胞存活率。

4） 根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài),，約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基,。

5） 每日監(jiān)測細(xì)胞，觀察存活細(xì)胞率,，從而確定抗生素篩選開始4-6天內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染或者所有非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的藥物zui低濃度,。

4. 哺乳動(dòng)物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選

等轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)粒后，細(xì)胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中增殖,，以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子,。

1） 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞（原樣或稀釋）置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng),。

注：當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時(shí),，抗生素作用zui明顯。細(xì)胞過于密集,，抗生素產(chǎn)生的效力會(huì)明顯下降,。這時(shí)進(jìn)行細(xì)胞分盤使其密度不超過25%。

2） 每隔2-3天,，移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。

3） 篩選7天后評(píng)估細(xì)胞形成的病灶,。病灶可能需要額外的一周或者更多時(shí)間,，這依賴于宿主細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率。

注：每日進(jìn)行細(xì)胞生長狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要48h,，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天,。

4） 轉(zhuǎn)移和放置5-10個(gè)抗性克隆到一個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中，用選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天,。此次富集培養(yǎng)是為日后的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備,。

注意事項(xiàng)

1） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。

2） 嘌呤霉素為有毒化合物,，操作時(shí)請(qǐng)小心拿放。