G418 Sulfate遺傳霉素（抗生素）
產(chǎn)品簡介：

    哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，當(dāng)抗性基因neo被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組后 ,使其編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（amino-glycoside 3’-phosphotransferase,，APH(3)II）,。此酶通過共價(jià)修飾G418的氨基或羥基功能，抑制抗生素-核糖體間的相互作用,，從而使得抗生素失活,。這一特性賦予細(xì)胞產(chǎn)生抗性。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選實(shí)驗(yàn),，需要建立殺滅曲線（劑量反應(yīng)曲線）確定殺死無抗性細(xì)胞的zui低有效濃度,。植物細(xì)胞中，通過轉(zhuǎn)染攜帶nptII基因的抗性質(zhì)粒孵育其抗性,。nptII基因也能編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶,，這個(gè)酶使得多種抗生素喪失活性，包括G418,，卡那霉素和巴龍霉素,。

產(chǎn)品屬性：

英文同義名（English synonym） 中文同義名（Chinese synonym）	Antibiotic G418; G418 Sulfate; G418硫酸鹽,；遺傳霉素,；
CAS號(hào)（CAS No.）	108321-42-2
分子式（Molecular formula）	C20H40N4O10·2 H2SO4
分子量（Molecular weight）	692.7
外觀（Appearance）	白色粉末
純度（Purity）	~98%
活力（Potency）（anhydrous） 溶解性（Solubility）	>700 μg/mg 溶于水
結(jié)構(gòu)式（Structure）

G418 Sulfate遺傳霉素（抗生素）

運(yùn)輸與保存方法

常溫運(yùn)輸。粉末4℃避光保存,，避免受潮,，否則會(huì)降低抗生素活力。

使用方法

1. G418儲(chǔ)存液的配制（50 mg/mL,，活性濃度）

1.1活力單位的換算

根據(jù)此公式進(jìn)行換算：（1000/A₀）×A₁=A₂,，其中A₀是G418的活力值（Potency），因批次而異,?？梢娕螌?duì)應(yīng)的質(zhì)檢報(bào)告,，或者瓶子上的標(biāo)簽。A₁是想配制的活性G418濃度,。A₂是實(shí)際稱重的粉末與體積比濃度,。

比如若所用批次的G418 活力值為：750 µg/mg，要配制50 mg/mL的G418活性濃度,，則實(shí)際要配制的粉末濃度為1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL,。

如果配制10 mL的G418儲(chǔ)存液（活性濃度，50 mg/mL）,，則需要稱取663.3 mg粉末,。

1.2除菌和保存

根據(jù)上述換算得到的實(shí)際粉末稱重量，加入10 mL無菌去離子水內(nèi)使其*溶解,。

先用5 mL無菌去離子水預(yù)濕潤0.22 μm針頭式過濾器,，除盡水。之后使用此濾器過濾,，除菌后分裝成單次使用的小量（如1mL）放到-20℃凍存,，1年穩(wěn)定。

【注】：①不要對(duì)混濁的溶液進(jìn)行過濾,，因?yàn)榛鞚岬娜芤阂馕吨?溶解,，過濾過程中會(huì)造成藥物損失，降低終液的活性,。②不建議使用液體培養(yǎng)基,，NaCl,磷酸鹽溶液或者有機(jī)溶劑來制備儲(chǔ)存液。

2. 常用篩選濃度

一般來說,，剛開始篩選轉(zhuǎn)化子需要高濃度的G418,，并用一個(gè)較低濃度的G418用于維持培養(yǎng)。生長條件,，細(xì)胞類型和其他的環(huán)境因素都可能影響G418的用量,，因此*次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過殺滅曲線（kill curve），即劑量反應(yīng)性曲線,，來確定篩選濃度,。

通常情況，哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選范圍200-2000 μg/mL,；植物細(xì)胞：10-100 μg/mL,；酵母細(xì)胞：500-1000 μg/mL；

以下是一些細(xì)胞類型使用篩選使用的濃度,，可做參考:

 3. 殺滅曲線的建立

【注】：為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素zui低濃度,，可通過建立殺滅曲線（劑量反應(yīng)曲線）來實(shí)現(xiàn),，至少選擇6個(gè)濃度。處理分裂期的細(xì)胞時(shí)G418的活性強(qiáng),，因此在添加G418之前需要讓細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間,。

1) *天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃,，CO₂培養(yǎng)過夜,；

【注】：對(duì)于需要更高密度來檢測活力的細(xì)胞，可增加接種量,。

2) 根據(jù)細(xì)胞類型,，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例,，可設(shè)定0,，50，100,，200,，400，800,，1000 μg/mL,。

3) 第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基,。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔,。

4) 接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。

5) 按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長的恰當(dāng)濃度,。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的zui低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度,。

4. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選

4.1 轉(zhuǎn)染48 h后，用含有適當(dāng)濃度的G418篩選培養(yǎng)基來傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）,。

【注】：細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果超好,。則當(dāng)細(xì)胞過于稠密，其效率會(huì)降低,。為了得到較好的篩選效果,，將細(xì)胞稀釋至豐度不超過25%。

4.2 每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液,。

4.3 篩選7天后觀察并評(píng)估細(xì)胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間,，這取決于宿主細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染,，以及篩選效果,。

4.4 挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)板,，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

4.5 之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可,。

注意事項(xiàng)

1) 本品不可高壓滅菌,；

2)不要和其他的抗生素/抗真菌劑（如青霉素/鏈霉素）共同使用，因?yàn)樗鼈兪荊418的競爭性抑制劑,。其他的抗生素也會(huì)產(chǎn)生交叉活性,。

3) 配制G418溶液時(shí)，一定要根據(jù)G418批次不同的活力值（potency）來進(jìn)行換算,，從而得到需要活性濃度的儲(chǔ)存液以及工作液,。

4) G418加入培養(yǎng)體系中未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有可能不會(huì)被殺死，原因在于藥物濃度過低,，或者細(xì)胞密度過高,。另外，快速分裂的細(xì)胞相對(duì)于緩慢增殖細(xì)胞,，更容易被殺死,。對(duì)照細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染）可能抗生素添加5-7天后才能殺死，轉(zhuǎn)染細(xì)胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成,。

5) 即使加入殺死劑量的G418,，細(xì)胞可能會(huì)繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯,。

6) 為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。