為什么提取出的總RNA會(huì)降解?為什么OD260/280不在1.8-2.0之間,？

為什么,。,。,。小伙伴們?nèi)绻羞@些疑問的話，不防往下看看到底是為什么,。

1,、使用前防范：TRIzol劇毒且易揮發(fā)（由于主要成分是苯酚），lv仿呢也是一種有毒也易揮發(fā)的試劑,，有的小盆友為了防止氧化,，還會(huì)加入β巰基乙醇，這個(gè)反正建議有鼻子的童鞋都做好防護(hù),。提取RNA前做好保護(hù)措施,，在通風(fēng)廚中操作，所有接觸TRIzol的耗材,，扔到專門的密封的桶中,，等待處理。否則整個(gè)實(shí)驗(yàn)室都會(huì)彌漫著氣味,！

2,、*前奏：所有耗材（槍頭、EP管）均經(jīng)過RNA酶滅活或者直接購買無RNA酶的耗材,，除RNA酶主要方法是用DEPC水浸泡48小時(shí)（DEPC雖然味道香,，但卻是強(qiáng)致癌的，泡管子的時(shí)候別一直去聞它,，一般來說煮沸或高溫高壓滅菌15min后,，DEPC就會(huì)降解成二氧化碳和水），操作前戴口罩。

3,、RNA非常容易降解,，所有步驟盡量在冰盒里面操作，包括離心時(shí)需用4度預(yù)冷的離心機(jī),。

4,、1-5×10^7細(xì)胞或者50-100mg組織加入1ml TRIzol，細(xì)胞或者組織過多,，TRIzol過少會(huì)導(dǎo)致裂解不充分,，內(nèi)源性RNA酶抑制不*，導(dǎo)致RNA降解,。

5,、TRIzol加入細(xì)胞后，反復(fù)吹打,，充分裂解細(xì)胞至均一透亮,，不粘稠為止。

6,、加入Lv仿后充分混勻,，其實(shí)這步也不能過于劇烈，上層的水相含有RNA,，中間的組織相含有DNA和蛋白質(zhì),，剩余的一部分DNA會(huì)萃取到lv仿中，同時(shí)lv仿具有使蛋白質(zhì)變性的作用,，離心完,，中間那層就是組織層。

7,、離心后,，溶液分層，上層為含有RNA的水相,，中間層乳白色的為含有部分DNA,、蛋白質(zhì)的組織層，下層紅色的為含有DNA和部分蛋白質(zhì)的lv仿, 此時(shí),，注意,，“寧少勿多”，提取上層無色液體時(shí),，小心輕柔,，可以用200ul的槍抽吸，特別注意：一般1ml的TRIzol時(shí)zui多可以提取500μl上清,，但是建議提取400ul以下,，千萬避免吸到中間的乳白色組織層,，否則zui后測量RNA時(shí)，OD260/280非常低,，會(huì)有蛋白混入,。

8、異丙醇加入的目的是為了使RNA沉淀,，此時(shí)RNA已經(jīng)提出來了,，應(yīng)輕輕混勻，避免RNA損傷,。離心后肉眼可見EP管底部白色羽毛狀沉淀即為RNA沉淀,。


9、75%乙醇加入的目的是為了洗滌和沉淀作用,，也應(yīng)該輕柔,。

10、zui后乙醇應(yīng)盡量充分揮干,，先用槍頭盡量把75%乙醇吸干,，再晾5min,，否則沒有晾干乙醇,，加入DEPC水時(shí)可能導(dǎo)致RNA白色沉淀不溶解。

11,、加入DEPC水溶解RNA時(shí),，可根據(jù)自己需要的濃度來調(diào)整加入DEPC水的量。

12,、RNA提取后可以跑瓊脂糖膠來判斷降解情況,，純的無降解的RNA跑完瓊脂糖膠后應(yīng)該有3條帶，26S,，18S,， 5S。其中5S很淡,，不容易看見,。如果條帶很淡，且有拖尾現(xiàn)象,，提示有RNA降解,。