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25-羥基維生素D檢測試劑盒用于定量檢測人血清中總的25-羥基維生素D含量。

背景簡介：

25-羥基維生素D是激活維持腸內(nèi)鈣吸收和平衡的一類甾類激素,。維生素D 有兩個亞型：維生素D2和維生素D3,。維生素D2來源于乳制品，而維生素D3在來源日光照射后的皮膚,。在肝臟內(nèi)維生素D 碳25位置發(fā)生羥基化,，形成25羥基維生素D。25羥基維生素D是維生素D的主要代謝循環(huán)產(chǎn)物,，被廣泛認為是反應(yīng)個體維生素D水平的準確的標記物。多種疾病與維生素缺乏相關(guān)：如骨質(zhì)疏松癥,、佝僂病,、軟骨病、癌癥以及多種心血管疾病。通過飲食補充的維生素D2和維生素D3都在肝臟中轉(zhuǎn)化為25-羥基維生素D,。血清或血漿中的25羥基維生素D2和D3的總濃度為被認為25羥基維生素D的總量,。維生素D缺乏的患者應(yīng)經(jīng)常檢測血清或血漿中的25-羥基維生素D含量，通過補充維生素D使維生素D含量達到*水平,，同時避免因過量補充維生素D引起維生素D水平超標,。

檢測原理：

試劑盒采用競爭ELSIA 檢測方法。包被有維生素D的96孔板與標準品,、對照,、檢測樣本和生物素標記的維生素D室溫孵育90min。孵育過程中,，生物素標記的維生素D與樣品,、標準品及質(zhì)控中的維生素D競爭結(jié)合包被的維生素D抗體。洗滌后,，通過HRP標記的鏈親合素（SA-HRP）與結(jié)合的生物素標記的維生素D反應(yīng),，連檢測維生素D含量。樣本中的維生素D含量越高,，生物素標記的維生素D含量越少,。未結(jié)合的SA-HRP在被洗掉，加入TMB 室溫孵育30min,，有藍色出現(xiàn),。加入終止液，讀取450nm吸光度,。用吸光度和和標準品濃度做標準曲線,。顏色深淺與25-OH維生素D含量成反比關(guān)系。整個過程為2.5小時,。

樣本收集和處理

血清樣本-通過靜脈采血，血凝集后,，盡快分離血清,。請不要用溶血的樣本。

新鮮血清可在2-8℃儲存兩周,。長期保存,，請在-20℃一下保存，避免反復凍融,。測定前,，樣本需置于室溫平衡30min。

試劑制備：

檢測前請?zhí)崆爸苽湟韵略噭?/span>

1. 標準品和試劑：

血清為即用型,，用前請在室溫平衡,。

1. 51X生物素標記：用前稀釋,，用稀釋液制備1X工作稀釋液（例如：5ml稀釋液中加入：0.1ml 51X的生物素標記的VitaminD），剩余的稀釋液應(yīng)置于2-8℃避光,，封閉保存,。
2. 制備1X洗滌緩沖液：20X稀釋液(25ml)，加入475ml蒸餾水,。室溫保存（18-24℃,。）

操作程序：

所有的樣本和檢測試劑在用前都需室溫平衡。

1. 標準品,，對照,，樣本加入10ul到對應(yīng)孔。
2. 加入200 ul 生物素標記的25-OH維生素到各孔,。
3. 振板儀200-400rpm 振板20s,，充分混勻。用封板膜封板,。
4. 封板后,，室溫孵育90min。
5. 去掉封板膜,。
6. 倒掉孔內(nèi)液體,。
7. 洗滌：加入300ul1X洗滌緩沖液到各孔，然后倒掉,，在吸水紙上拍干,。重復洗滌三次。
8. 加入200ul Streptavdin-HRP到各孔,。
9. 室溫孵育30min,。
10. 倒掉孔內(nèi)液體。
11. 洗滌：加入300ul1X洗滌緩沖液到各孔,，然后倒掉,，在吸水紙上拍干。重復洗滌三次,。
12. 用排槍加入：200ul TMB到各孔,。
13. 室溫避光孵育30min。
14. 終止：加入50ul終止液終止反應(yīng),。輕輕混勻20-30s,。
15. 加入終止液10分鐘內(nèi)，讀取450nm吸光度,。