一、測(cè)定用乙醇固定的DNA的含量
1,、培養(yǎng)細(xì)胞的DNA含量的測(cè)定
制備單細(xì)胞懸液于200μl的PBS緩沖液中,；
加入2ml預(yù)冷的70%乙醇，4℃保存,；
附:細(xì)胞固定的一般步驟
1) 取單細(xì)胞懸液1～2×106個(gè)細(xì)胞于PBS（PH=7.2）緩沖液中,；
2) 300g離心5分鐘，棄上清,，反復(fù)兩次,；
3) 重懸細(xì)胞于0.5ml PBS緩沖液中；
4) 將細(xì)胞懸液放置于2～3ml冷70%乙醇中,，混勻,，保存于4℃，至少30分鐘。在4℃條件下可保存2~3周,。
注意：
² 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求,，固定劑也可選用1～3%多聚甲醛；
² 將乙醇作為固定劑時(shí),，乙醇應(yīng)預(yù)冷至0～4℃,；
² 細(xì)胞在固定時(shí)，固定劑應(yīng)緩慢滴入細(xì)胞懸液中,，使固定劑的濃度緩慢增加,，并不斷震搖，以免細(xì)胞成團(tuán)（特別是用乙醇固定時(shí)）,。
² 300g離心5分鐘，去上清,，再重懸于400μl PBS中,；
² 顯微鏡下觀察，若有明顯的黏附,，須再用篩網(wǎng)過濾,；
² 加入PI（含Rnase），避光孵育30分鐘,；
² 上機(jī)檢測(cè),。
2、新鮮組織的DNA含量的測(cè)定
1) 用200mg濕重組織用機(jī)械法制成單細(xì)胞懸液,；
2) 500g離心5分鐘,；
3) 棄上清，重懸于10ml染色-去污劑中,；
4) 再過濾,，用200目的篩網(wǎng)或70~80μm的篩網(wǎng)過濾；
5) 上機(jī)檢測(cè),。
3,、石蠟包埋組織切片的DNA含量的測(cè)定
1) 從石蠟包埋切取切片50 μm厚，2~3片,，制成單細(xì)胞懸液,；
2) 用PBS緩沖液洗滌，500g離心5分鐘,，棄上清,；
3) 加入PI液1ml室溫避光30分鐘；
4) 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml,；
5) 上機(jī)檢測(cè),。
二、細(xì)胞凋亡檢測(cè)及相關(guān)分子檢測(cè)
1、細(xì)胞DNA含量分布（由細(xì)胞DNA降解方式檢測(cè)細(xì)胞凋亡）
² 收集已固定的單細(xì)胞懸液約5×105~1×106/ml,；
² 離心除去固定液,，3ml PBS重懸細(xì)胞;
² 1500rpm離心，5分鐘 ,，棄去PBS,；
² 加PI染液1ml，室溫避光20分鐘,；
² 調(diào)整細(xì)胞濃度5×105/ml,；
² 上機(jī)檢測(cè)。
2,、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡
1) 常規(guī)制備單細(xì)胞懸液,用PBS洗兩次.(若為全血要先溶 血),取約5×106個(gè)細(xì)胞,，1500rpm離心,棄上清,用400μl 1×Binding Buffer重懸；
2) 分成a,、b,、c、d,、e五管,，每管約1×106個(gè)細(xì)胞
a) 陰性對(duì)照，不加任何試劑,；
b) 陽性對(duì)照,加2%多聚甲醛固定30分鐘,加AnnexinV 5μl,室溫10min,用1×Binding Buffer洗一次,棄上清再加190μl 緩沖液,、10μl PI避光15分鐘
c) 加10μl PI，避光孵育15分鐘,；
d) 加5μl AnnexinV液,，室溫避光孵育15min；
e) 加10μl PI和5μl AnnexinV液,，室溫避光孵育5min,；
3) 每管各加400μl 1×Binding Buffer。
4) 上機(jī)檢測(cè),。
注意 a. 操作動(dòng)作要盡量輕柔,，勿用力吹打細(xì)胞；
b. 操作時(shí)注意避光,；
c. 反應(yīng)完畢后盡快檢測(cè),，在一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。
3,、用單克隆抗體APO2.7檢測(cè)細(xì)胞凋亡
1) 放置0.5~1×106個(gè)細(xì)胞到試管中,；
2) 室溫離心200g，6min,；
3) 棄上清,，加入100μl冷的（4℃）在PBSF溶液中含100µg/ml的digitonnin，輕輕地重懸細(xì)胞，在冰上孵育20min,；
4) 加入2ml冷的（4℃）PBSF液,，室溫離心200g，6min,；
5) 棄上清,，加入20μl PE標(biāo)記的Apo2.7 單克隆抗體和80μl PBSF液，用vortex輕輕震蕩,，室溫避光孵育15分鐘,；
6) 加入2ml PBSF液，室溫離心200g,，6min,；
7) 棄上清，加入1ml PBSF液重懸細(xì)胞,；
8) 避光保存,，直到流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
PBSF：含2.5% FCS（v/v）和0.01%NaN3（w/v）的PBS,。
三、用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA周期分析
1,、方法：同DNA含量檢測(cè)
2,、注意：
單細(xì)胞濃度應(yīng)約106/ml，以免影響檢測(cè)的CV值和檢測(cè)結(jié)果,；
制備完成后的標(biāo)本應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查其質(zhì)量（如細(xì)胞是否聚集或過多碎片）,，以保證得到足夠的細(xì)胞含量；
醛類固定會(huì)影響PI與核酸的結(jié)合,。
四,、免疫熒光標(biāo)記法
1、細(xì)胞膜上的免疫熒光檢測(cè)法
間接標(biāo)記法
1) 制備單細(xì)胞懸液,；
2) 細(xì)胞計(jì)數(shù),，取出1×106個(gè)細(xì)胞于試管中；
3) 用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù),，要求活細(xì)胞數(shù) >90～95%,；
4) 在試管中加入一抗，（劑量按照說明書的要求）,，孵育30～60分鐘,；
5) PBS洗滌1～2次，1500rpm,，離心3分鐘,，棄上清；
6) 加入二抗，孵育20～30分鐘,；
7) PBS洗一次,，1500rpm，離心3分鐘,，棄上清;
8) 加300μl PBS,，上機(jī)檢測(cè)(若不能及時(shí)上機(jī)檢測(cè)，可加1ml 1%多聚甲醛固定,，可放置1周),。
直接標(biāo)記法
①～③同間接標(biāo)記法
④在試管中加入熒光標(biāo)記的抗體，混勻,，孵育30分鐘,；
⑤用PBS洗2次，1500rpm,，離心3分鐘,，棄上清;
⑥加300μl PBS(PH=7.4)，上機(jī)檢測(cè),。
2,、 細(xì)胞膜內(nèi)的免疫熒光標(biāo)記法
間接免疫熒光標(biāo)記法
1) 取已制備好的單細(xì)胞懸液，用1～3%的多聚甲醛固定30分鐘（也可4℃保存Overnight）,；
2) 用PBS洗兩次,，棄上清；
3) 細(xì)胞膜打孔,，加入0.1%皂素 200μl,，室溫10分鐘；
4) 用PBS洗滌兩次,；
5) 加入*抗體,，室溫30～60分鐘，或4℃Overnight,，同時(shí)須設(shè)陰性對(duì)照或同型對(duì)照管,；
6) 用PBS洗滌兩次；
7) 加入二抗（熒光標(biāo)記的抗體）室溫20分鐘,，避光,；
8) 用PBS洗滌1～2次，棄上清,；
9) 重懸細(xì)胞于500μlPBS中,，上機(jī)檢測(cè)。
直接熒光標(biāo)記法
①～⑤同間接熒光標(biāo)記法,；
加入熒光素標(biāo)記好的抗體,，避光30分鐘（同時(shí)做同型對(duì)照管）,；
用PBS洗滌１～２次，棄上清,；
加300μl PBS上機(jī)檢測(cè),。
細(xì)胞膜上及細(xì)胞內(nèi)雙標(biāo)記法（直標(biāo)法）
1) 取出已制備好的未固定的單細(xì)胞懸液1×10 6個(gè)細(xì)胞于試管中；
2) 用PBS洗滌兩次,；
3) 加入用熒光素標(biāo)記的抗體來標(biāo)記細(xì)胞膜上的抗原,，同時(shí)加上陰性對(duì)照管，室溫孵育20分鐘,；
4) 在試管中加入1％～3％多聚甲醛1ml,，固定30分鐘；
5) PBS洗滌兩次1500rpm 3分鐘,，棄上清;
6) 打孔,，加入0.1％皂素200μl室溫10分鐘;
7) 用PBS洗滌兩次，棄上清;
8) 加入用熒光素標(biāo)記的抗體,，標(biāo)記膜內(nèi)的抗原（標(biāo)記膜內(nèi)的抗體的熒光素的顏色與膜上標(biāo)記的熒光素的顏色務(wù)必不相同）室溫20分鐘孵育;
9) 用PBS洗一遍棄上清；
10) 用300μlPBS重懸細(xì)胞,，上機(jī)檢測(cè)
五,、流式細(xì)胞術(shù)中的幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：
1、對(duì)照組的設(shè)置：
在流式細(xì)胞術(shù)中所測(cè)得的量都是相對(duì)值,，不是值,。如需知道值時(shí)必須設(shè)置對(duì)照組樣品。對(duì)照組樣品包括有陰性對(duì)照和陽性對(duì)照,。
（1）、陰性對(duì)照的設(shè)置
² 在實(shí)驗(yàn)過程中,，如做間接標(biāo)記法,，可設(shè)置與一抗無關(guān)的實(shí)驗(yàn)，即在實(shí)驗(yàn)中不加一抗而只加上帶有熒光標(biāo)記的第二抗體作為陰性對(duì)照管,，作為陰性對(duì)照。
² 在實(shí)驗(yàn)過程中,，假設(shè)做直接標(biāo)記法,，可設(shè)置理論上的陰性細(xì)胞作為陰性對(duì)照管,，實(shí)驗(yàn)過程及步驟與實(shí)驗(yàn)組務(wù)必相同。（做間接標(biāo)記法時(shí),，同樣也可同時(shí)設(shè)置“陰性細(xì)胞”的陰性對(duì)照管作為陰性對(duì)照,。
² 在實(shí)驗(yàn)過程中,，假設(shè)做直接標(biāo)記法，可將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,，取一管,，加上與實(shí)驗(yàn)抗體所標(biāo)記的熒光顏色相同的同型對(duì)照來作為陰性對(duì)照,。
（2）,、陽性對(duì)照的設(shè)置：
在實(shí)驗(yàn)過程中如涉及到表達(dá)缺失或減少的實(shí)驗(yàn),，應(yīng)設(shè)置陽性對(duì)照組,，其設(shè)置方法與陰性對(duì)照設(shè)置相同,。
2,、幾點(diǎn)建議：
1) 在實(shí)驗(yàn)過程中，在保證實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上,，應(yīng)盡量減少實(shí)驗(yàn)工序和過程,。由于間接標(biāo)記法的工序多，實(shí)驗(yàn)過程長(zhǎng),，如再加之操作的不熟練，細(xì)胞更容易丟失和受損,，而造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差。因此,，在條件允許的范圍內(nèi)，建議盡量做直接標(biāo)記法而不去做間接標(biāo)記法,，以保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性和準(zhǔn)確性,。
2) 建議送檢細(xì)胞一定要足夠量,，一般要求1×106個(gè)細(xì)胞,。不要過少。因?yàn)?，如?xì)胞太少檢測(cè)時(shí)樣本流量相對(duì)會(huì)增大從而影響變異系數(shù)，結(jié)果也不可信,。細(xì)胞量也不宜過多，因細(xì)胞量太多加入的抗體或染料相對(duì)不足，結(jié)果也由此受影響,。
3) 同一種細(xì)胞需同時(shí)做雙標(biāo)記時(shí)，須做雙標(biāo)記的同型對(duì)照,，且兩種抗體所標(biāo)記的熒光顏色務(wù)必不同。
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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