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D產(chǎn)品貨號：354143 354144 354147 354148

儲存和運(yùn)輸：-20度儲存，干冰運(yùn)輸,。

操作指南：

血管生成過程中,，內(nèi)皮細(xì)胞活化后表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），可降解血管基底膜,。BD Biocoat內(nèi)皮細(xì)胞侵襲系統(tǒng)提供了抗/促血管再生化合物的體外定量實驗?zāi)Ｐ?。?nèi)皮細(xì)胞侵襲系統(tǒng)包括：BD Falcon 24多孔板培養(yǎng)小室，含配套接收板和蓋子：BD FluoroBlok熒光屏蔽3.0μm孔徑PET膜,，預(yù)包被Matrigel基質(zhì),。具體操作步驟如下：

凍融：

從-20℃冰箱中取出包裝，使其自然升溫到室溫,。

遷移實驗：用BD鈣黃綠素Calcein AM熒光染色劑后標(biāo)記

細(xì)胞在BD FluoroBlokTM 基質(zhì)膜遷移后，采用熒光標(biāo)記定量,，只有遷移到下室的細(xì)胞可以計算得到,。根據(jù)實時動力曲線的計算，推薦使用前標(biāo)記法,。

2.1 原代HUVEC細(xì)胞的遷移能力取決于其來源和所傳代數(shù),。可以先對HUVEC遷移能力進(jìn)行預(yù)篩選,，推薦使用所傳代數(shù)較低,，8代以內(nèi)的HUVEC。

2.2 HUVEC細(xì)胞在血清培養(yǎng)基或生長因子VEGF優(yōu)化的培養(yǎng)基中生長,，會對不同的內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)劑產(chǎn)生不同的應(yīng)激反應(yīng),。

建議在實驗前將細(xì)胞饑餓4-5小時，而后去除生長培養(yǎng)基,，清洗細(xì)胞單層,，加入含0.1%BSA的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不含血清或生長添加劑）。

2.3 HUVEC細(xì)胞懸液可用胰酶消化后制備，然而,，采用非酶技術(shù)消化細(xì)胞,，更能保存細(xì)胞遷移的應(yīng)激能力?？刹捎脤I(yè)培養(yǎng)基Specialty Media (產(chǎn)品號：S-014-B)作為非酶消化的離散劑,。

注意：大部分內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基不具有足夠的血清濃度用于終止胰酶的消化。

2.4 接種細(xì)胞濃度同實驗條件,，如細(xì)胞來源,，培養(yǎng)基，化學(xué)誘導(dǎo)物決定,。推薦起始濃度為：4.0×105 cells/mL 24孔板或3.3×105個/mL 96孔板,。推薦接種體積分別為250μL和75μL.

2.5 推薦的化學(xué)誘導(dǎo)物體積分別為24孔板，750微升,，96孔板,，225微升。

注意：為了減少氣泡和優(yōu)化熒光讀板的性能,，推薦通過進(jìn)樣口在配套板內(nèi)添加試劑,。

2.6 小室和對照小室在37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)22±1小時,。

3,、細(xì)胞遷移的計算：用BD鈣黃綠素Calcein AM 熒光染色劑后標(biāo)記定量。

注意：鈣黃綠素的濃度在4-5μg/mL（HBSS溶液）,。采用培養(yǎng)基用于熒光染色劑的稀釋會引起熒光染色劑自動水解,，并帶來高背景熒光。

對一塊完整的24孔板來說,，需要一管溶解于12.5mL HBSS的50μg的染色劑,。96孔板則需要2管溶解于25mL HBSS的50μg染色劑。

3.1 在各管50μg鈣黃綠素中加入20 μL DMSO,，加入150μL 37℃預(yù)熱的HBSS,。將其轉(zhuǎn)入大量的HBSS中，用150μL預(yù)熱的HBSS清洗熒光染料的容器,。

3.2標(biāo)記有2種方法

*種適用于大規(guī)?？装宓淖詣踊訕硬僮鳌Ｐ∈液涂装鍍?nèi)的培養(yǎng)基通過加樣口添加,。通過進(jìn)料口加入HBSS清洗孔板和膜底部（24孔板需500μL,96孔板需200μL）,，反復(fù)抽吸。在24孔板中加入500μL鈣黃綠素,，96孔板中加入225μL,。

第二種方法是手動操作較水?dāng)?shù)量的培養(yǎng)板,。取出培養(yǎng)小室，輕搖后去除溶液,。去除培養(yǎng)基后,，將小室轉(zhuǎn)入另一塊新的培養(yǎng)板，該培養(yǎng)板在,、預(yù)先溶有染色劑（24孔板,，每孔500μL，96孔板每孔225μL）,。

3.3 在37℃,，5%CO2環(huán)境下孵育90分鐘。

3.4 培養(yǎng)小室的熒光定量信息通過熒光板讀板機(jī)底部讀數(shù)取得,，激發(fā)波長494nm ,，發(fā)射波長517nm。只有遷移后通過Martigel FluoroBlok膜的被標(biāo)記的細(xì)胞才能被檢測,。

4,、遷移研究：DilC12(3)熒光染色預(yù)標(biāo)記法

細(xì)胞接種于孔板之前先用染色劑標(biāo)民，可用于均一化實驗,，所產(chǎn) 生的實時動力數(shù)據(jù)可提示細(xì)胞通過基底膜侵襲的動力曲線,，不需要分解和破壞各個時間點(diǎn)。

4.1 如1.所示凍融,。

4.2 不同濃度的各類熒光素對細(xì)胞標(biāo)記的程度不同,，標(biāo)記濃度和時間，接種細(xì)胞濃度和化學(xué)誘導(dǎo)劑必須預(yù)先優(yōu)化,。

4.3 接種密度參見步驟2.在小室內(nèi)加入0.5 mL 37℃預(yù)熱的基本培養(yǎng)基,，在37℃，CO2環(huán)境下孵育15-45分鐘,，待用,。

4.4 培養(yǎng)小室的熒光定量信息通過熒光板讀板機(jī)底部讀數(shù)取得，激發(fā)波長549nm,，發(fā)射波長565nm,。只有遷移后通過Matrigel FluoroBlok膜的被標(biāo)記的細(xì)胞才能被檢測,。

5,、結(jié)果計算

注意：數(shù)據(jù)可以用相對熒光值RFU或遷移百分比表示，后者在標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)處理中更有用,。

背景扣除：計算平均背景值,，將其從各個孔板中扣除。

遷移百分比%=受化學(xué)誘導(dǎo)的跨膜遷移的細(xì)胞平均熒光值/不受化學(xué)誘導(dǎo)的跨膜遷移的細(xì)胞平均熒光值×100

自動化操作注意事項

1 BD Falcon FluoroBlok 24孔板培養(yǎng)小室系統(tǒng)能適用于自動化操作系統(tǒng),。蓋子可以用標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械手取走,，也可用吸力取走,。

2 為了避免各孔間污染，孔板設(shè)定為一個統(tǒng)一的方向,。為了培養(yǎng)小室匹配,，確保Falcon的商標(biāo)均在2者上方，面向同一個方向,。

3 對于96 孔板培養(yǎng)小室,，需使用錐形頭或窄孔口的吸頭。寬口槍頭會粘在儲存口上,，不利操作,。

4 任何規(guī)格的槍頭都能達(dá)到小室的兩邊。包括50μL,，100μL,， 200μL，250μL,，1000μL,。