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摘要：目的建立流式細(xì)胞儀測定血小板胞漿游離鈣離子濃度\[Ca2+\]i的方法,。方法 用Fluo3AM作為鈣指示劑,，在有或無細(xì)胞外鈣\[Ca2+\]o存在的條件下，測定靜息和凝血酶激活狀態(tài)下人血小板胞漿游離鈣離子濃度\[Ca2+\]i的變化,。結(jié)果Fluo3AM標(biāo)記的血小板的平均熒光強(qiáng)度明顯增加,。凝血酶使負(fù)載Fluo3AM標(biāo)記的血小板胞漿\[Ca2+\]i明顯增加，且顯示劑量依賴和對\[Ca2+\]o的依賴,。結(jié)論凝血酶引起血小板胞漿\[Ca2+\]i增加的來源主要是\[Ca2+\]o,，可能也有部分是內(nèi)鈣釋放的參與。

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞儀,；血小板,；鈣；凝血酶
                     
Determinationofthelevelofcytoplasmicfreecalcium
inhumanplaetswithflowcytometry

ZhuangMingming,WenYixin,LiuShaolie,HongXiaopeng

（DepartmentofClinicalLaboratoryofOverseasChineseHospital,Puning515300,China）

ABSTRACT:ObjectiveTosetupamethodtodeterminecytoplasmicfreecalcium\[Ca2+\]iinhumanplaetswithflowcytometry.MethodsAsacalciumindicator,Fluo3AMwasusedtodeterminethechanges,inducedbythrombin,ofthelevelofplaetplasmafreecalcium\[Ca2+\]iinpresenceorabsenceofoutsidecalcium\[Ca2+\]o,inordertoelucidatewheretheplaetplasmafreecalcium\[Ca2+\]imainlycomefromanditsroleintheactivityofplaets.ResultsThegeometricmeanoffluorescenceintensityoftheplaet,labeledwithFluo3AM,wasincreasedobviously.Theconcentrationofplaetplasmafreecalcium\[Ca2+\]iwasincreasedsignificantlybythrombininadoseand\[Ca2+\]odependentmanner.ConclusionTheincreasedlevelofplaetplasmafreecalcium\[Ca2+\]o,inducedbythrombin,mainlycomesfrom\[Ca2+\]oandpartlyfromthereleased\[Ca2+\]oofintraplaetprobably.

KEYWORDS:flowcytometry;plaet;calcium;thrombin

血小板胞漿游離鈣離子\[Ca2+\]i與血小板的許多形態(tài)與功能活動有關(guān),，如血小板形態(tài)的改變、聚集,、收縮,、釋放、分泌等,。也與血小板參與的凝血,、血液流變性調(diào)節(jié)（如血液黏度、流動性等）以及動脈粥樣硬化,、腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展,、血管內(nèi)皮活動等生理、病理過程有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)\[1\],，當(dāng)血小板內(nèi)的\[Ca2+\]i達(dá)到一定的閾值（400nmol/L）就會發(fā)生釋放反應(yīng)以及可逆性聚集,。達(dá)到另一個(gè)閾值（800nmol/L），就會發(fā)生不可逆性聚集,。因此,，研究血小板胞漿游離鈣濃度的變化，對闡明血小板參與和調(diào)節(jié)的許多生理生化以及病理過程有重要意義,。人們常用鈣熒光指示劑（水母素,、Quin2、fura2,、Fluro2AM,、Fluo3Am）和雙波長熒光光度術(shù)測定細(xì)胞胞漿游離鈣濃度\[2-4\]。本文在建立流式細(xì)胞術(shù)法測定血小板胞漿游離鈣濃度的基礎(chǔ)上,，研究了凝血酶誘導(dǎo)的人血小板胞漿游離鈣濃度的變化,。

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1血液樣本       

成人血樣，男女兼有,，1個(gè)月內(nèi)沒有服用阿司匹林及其他影響血小板功能的藥物,。空腹肘靜脈采血,，用ACD（ACD∶血=1∶6）抗凝,。

1.1.2藥品與試劑       

Fluo3AM（溶于DMSO中）、EGTA（溶于超純度去離子水中）,、TritonX100,、ADP、凝血酶,、小牛血清白蛋白（BSA）,，均為Sigma（USA）公司產(chǎn)品。ACD（mmol/L：枸櫞酸7,枸櫞酸三鈉85,，葡萄糖100）,。Hepes緩沖液（mmol/L:NaCl145,KCl5,MgSO41.0,Hepes10,Na2HPO40.5,葡萄糖10,pH7.4）。CaASAHepes緩沖液（在Hepes緩沖液中加入120mmol/LCaCl2和0.94mmol/LASA,，pH7.4）,。CaHepes緩沖液（在Hepes緩沖液中加入120mmol/LCaCl2，pH7.4）,。其他試劑均為市售產(chǎn)品,。

1.1.3主要儀器       

FACSCalibur型流式細(xì)胞儀，美國BectonDickinson公司產(chǎn)品,。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1富血小板血漿（PRP）制備       

抗凝血200×g離心10min,，取上清即得富血小板血漿（PRP）,。

1.2.2負(fù)載Fluo3AM血小板懸液制備       

取PRP，加入乙酰水楊酸（ASA）,，使終濃度為0.94mmol/L,。輕輕搖勻后800×g離心10min，棄上清,。取沉淀的血小板,，加入CaASAHepes緩沖液1mL，800×g離心10min,，棄上清,。取沉淀的血小板，加入CaASAHepes緩沖液重懸血小板,，調(diào)節(jié)血小板濃度為2×109/mL,。在血小板懸液中加入BSA（終濃度為1.5g/L）和Fluo3AM（4.0μmol/L），輕搖混勻后,，在37℃水浴孵育30min后,，800×g離心10min，棄上清,，用1mLCaHepes緩沖液重復(fù)2次,，洗去溶液中多余的Fluo3AM。用Hepes緩沖液重懸血小板,，調(diào)節(jié)其濃度為2×106/mL,。

1.2.3流式細(xì)胞儀測定血小板胞漿\[Ca2+\]i        

取負(fù)載Fluo3AM的血小板懸液0.5mL，加入3mL聚乙烯試管中,，用CellQuest軟件獲取和分析數(shù)據(jù),，激發(fā)波長為488nm，測定時(shí),，用側(cè)向角（SSC）F1（Fluo3AM）散點(diǎn)圖識別血小板,，用F1直方圖測定平均熒光強(qiáng)度。每個(gè)樣本獲取10000個(gè)血小板,。用CrykiewiczG\[5\]的等比值法公式計(jì)算出血小板胞漿\[Ca2+\]i：\[Ca2+\]i＝Kd×（F－Fmin）/（Fmax－F）式中Kd是Ca2+結(jié)合Fluo3AM的解離常數(shù),，為204nmol/L（37℃）。F為各樣本熒光強(qiáng)度的測定值,。Fmax和Fmin分別是zui大熒光強(qiáng)度和zui小熒光強(qiáng)度的測定值,。

zui大熒光強(qiáng)度和zui小熒光強(qiáng)度的測定：在各試管中加入60g/LTritonX100、5mmol/LCaCl2,，搖勻,，靜置10min,，用流式細(xì)胞儀測定平均熒光強(qiáng)度,，此乃zui大熒光強(qiáng)度,。用無鈣的Hepes緩沖液重懸血小板，調(diào)其濃度為2×106/mL,，加入25mmol/LEGTA（鈣特異性絡(luò)合劑）,，搖勻，靜置10min,，用流式細(xì)胞儀測定平均熒光強(qiáng)度,，此乃zui小熒光強(qiáng)度。

1.2.4凝血酶對血小板胞漿\[Ca2+\]i的影響       

分別研究緩沖液中有鈣和無鈣存在時(shí),，凝血酶對血小板胞漿游離鈣濃度的影響,。在CaASAHepes緩沖液和無鈣的Hepes緩沖液中加入凝血酶10、100,、1000U/L,，用此緩沖液制備負(fù)載Fluo3AM的血小板懸液，用流式細(xì)胞儀測定10000個(gè)血小板的平均熒光強(qiáng)度,。為了觀察血小板\[Ca2+\]i隨時(shí)間的變化,，分別在加入凝血酶后5、10,、15min時(shí)各測定一次,。
〖2〗西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）〖3〗第26卷5期〖2〗莊明明，溫奕欣,，劉少列,，等.流式細(xì)胞儀測定血小板胞漿游離鈣濃度1.3       統(tǒng)計(jì)學(xué)方法       所用數(shù)據(jù)用±s表示，用SPSS10.0version軟件和tstudenttest法統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。

2.1人血小板胞漿\[Ca2+\]i       

將樣本放置在樣本架上,，按下"run"按鈕，開始獲取數(shù)據(jù),，以未標(biāo)記熒光素的樣本為空白對照,，并用它調(diào)整陰性區(qū)域的位置，然后依次測定各個(gè)樣本,。結(jié)果見圖1,。

2.2在外鈣\[Ca2+\]o存在時(shí)凝血酶刺激對人血小板\[Ca2+\]i的影響       

在1mmol/L\[Ca2+\]o存在時(shí)，血小板靜息\[Ca2+\]i為（108.9±10.5）nmol/L（n=8）,，在加入10,、100、1000U/L凝血酶后,，血小板\[Ca2+\]i明顯上升,，而且有明顯的劑量依賴關(guān)系（表1）。100U/L凝血酶可以使\[Ca2+\]i增加6.4倍,。5min時(shí),，血小板\[Ca2+\]i水平較開始加入凝血酶時(shí)降低,，10min時(shí)接近于靜息水平。

2.3無外鈣\[Ca2+\]o存在時(shí)人血小板\[Ca2+\]i對凝血酶刺激的反應(yīng)       

在緩沖液中沒有鈣存在的情況下,，血小板的\[Ca2+\]i為（29.5±5.6）nmol/L（n=8）,，緩沖液中凝血酶的水平為10、100,、1000U/L時(shí),，血小板\[Ca2+\]i的水平有所上升，但上升的程度明顯小于有外鈣時(shí),。100U/L凝血酶使血小板\[Ca2+\]i增加1.3～1.5倍,，并在5min時(shí)恢復(fù)到靜息水平（表1）。表1有或無\[Ca2+\]o時(shí)凝血酶對血小板\[Ca2+\]i的影響（略）
    
3討論

本實(shí)驗(yàn)使用的Fluo3AM為細(xì)胞可通透的細(xì)胞內(nèi)鈣熒光指示劑,，在沒有水解前和（或）無Ca2+存在時(shí),，不顯示熒光，低親和性結(jié)合測量到的瞬間Ca2+峰值比Fura2的高\(yùn)[6\],。TritonX100能增加細(xì)胞膜通透性,，提高胞漿內(nèi)Ca2+的濃度，因此,，用它測定胞漿內(nèi)Ca2+飽和濃度,。EGTA\[Ethylenelycolbis（2aminoethylether）-N,N,N′,N′tetraaceticacid\]是鎂存在時(shí)測定鈣濃度的鰲合劑\[7\]，也是有效的金屬蛋白酶的抑制劑\[8\],，在測定zui小熒光強(qiáng)度時(shí),，用EGTA絡(luò)合胞漿內(nèi)的Ca2+，使胞外的Ca2+濃度zui低,。ASA（乙酰水楊酸）是血小板穩(wěn)定劑,，可以防止血小板聚集，并保證血小板的功能完善,。

血小板靜息\[Ca2+\]i是指沒有任何刺激存在時(shí),，血小板胞漿的游離鈣濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,，\[Ca2+\]o為1mmol/L時(shí),，人血小板的靜息\[Ca2+\]i為（108.9±10.5）nmol/L；\[Ca2+\]o為0mmol/L時(shí),，其靜息\[Ca2+\]i為（29.5±2.6）nmol/L,。在血小板緩沖液中加入凝血酶后，血小板\[Ca2+\]i迅速上升,，而且有明顯的劑量依賴關(guān)系,。\[Ca2+\]o為1mmol/L時(shí)，0.01、0.1,、1.0U/mL的凝血酶使血小板內(nèi)游離鈣濃度分別上升1.58,、6.42和10.05倍。另外,，\[Ca2+\]o為0mmol/L時(shí)，凝血酶也使\[Ca2+\]i有所提高,，但提高的幅度明顯減少,，如0.01、0.1,、1.0U/mL的凝血酶使血小板內(nèi)游離鈣濃度分別上升0.13,、1.3和2.5倍。結(jié)果說明,，血小板\[Ca2+\]i的高低與\[Ca2+\]o存在與否有密切關(guān)系,。而且在凝血酶的刺激存在時(shí)，\[Ca2+\]i提高的程度也與\[Ca2+\]o有密切關(guān)系,。提示血小板內(nèi)鈣的升高主要依賴于\[Ca2+\]o的存在,，但不排除內(nèi)鈣釋放的參與\[9,10\]。

流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,，大大推進(jìn)了相關(guān)學(xué)科的發(fā)展,。結(jié)合熒光探針技術(shù)，對細(xì)胞表面抗原,、熒光蛋白表達(dá),、DNA含量及其細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等進(jìn)行大量,、多參數(shù)檢測與分析,，是流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)。我們應(yīng)用Fluo3AM和流式細(xì)胞術(shù)測定血小板\[Ca2+\]i,，因?yàn)镕luo3AM很容易進(jìn)入細(xì)胞,，熒光強(qiáng)度高，操作方法簡單易行,，測量靈敏度高,，重復(fù)性好，是研究細(xì)胞內(nèi)\[Ca2+\]i的有效方法,。

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