NPAS4 背景簡介：
神經(jīng)元活性參與信號通路，產(chǎn)生基因表達的改變,，導致神經(jīng)元的長期適應性變化,，這種變化是行為可塑性的基礎(chǔ)。自從30多年前發(fā)現(xiàn)去極化作用可以驅(qū)動C-Fos基因的轉(zhuǎn)錄以來,，關(guān)于興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)機制有大量研究,。突觸傳遞過程中通過NMDA受體進入的Ca2+離子和隨后去極化的L型電壓依賴性鈣通道充當?shù)诙攀梗瑓⑴c各種信號轉(zhuǎn)導途徑,，激活轉(zhuǎn)錄因子以驅(qū)動早期基因的轉(zhuǎn)錄,。
Fos、arc和egr1（zif268）等傳統(tǒng)IEG已被用作環(huán)境刺激驅(qū)動的神經(jīng)元活動的替代標記,，通過原位雜交,、免疫染色或轉(zhuǎn)基因動物等技術(shù)鑒定最近活躍的神經(jīng)元。這些神經(jīng)元的功能重要性在最近的研究中得到了證明,，這些研究利用fos的活性依賴性,，在恐懼條件反射期間激活的神經(jīng)元群中表達基因編碼的光遺傳工具或設(shè)計藥物受體。隨后對這些神經(jīng)元群的人工激活足以模擬恐懼反應 ,。
雖然傳統(tǒng)的IEG在識別活動依賴性回路方面發(fā)揮了重要作用,，但這些基因的表達可能并不適應神經(jīng)元活動。傳統(tǒng)的IEG轉(zhuǎn)錄是對突觸活動和Ca2+進入的反應,，也是對生長因子信號,、神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑通過cAMP信號的反應。
Figure 1: Npas4 is a pure marker of neuronal activity.
相比之下,，Michael Greenberg的實驗室表明,，神經(jīng)元特異性IEG npas4是由神經(jīng)元活動強烈而迅速誘導的，但對旁分泌因子沒有反應,。這種對神經(jīng)元活動的緊密調(diào)節(jié)表明,，Npas4可以成為神經(jīng)元活動的更特異的標志物。
為了尋找更多對npas4等活性進行純調(diào)節(jié)的基因,，我們對原代培養(yǎng)的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元進行了RNA-Seq實驗,，并比較了突觸活性或cAMP驅(qū)動的表達。
Figure 2: Genome-wide demonstration of npas4’s unique tuning to activity.
傳統(tǒng)的IEGs被突觸活性和cAMP上調(diào),。正如預期的那樣,，npas4被突觸活性上調(diào)。事實上,，在檢測到的所有約15000個轉(zhuǎn)錄本中,，npas4基因是誘導活性最高的，但正如Greenberg實驗室所預測的那樣,，cAMP不會上調(diào)npas4,。重要的是，沒有發(fā)現(xiàn)任何其他對神經(jīng)元活動表現(xiàn)出類似調(diào)節(jié)的基因,。
為了研究體內(nèi)npas4的誘導,，我們進行了情境恐懼條件反射（cFC）實驗，并用qPCR和RNA-Seq測量了海馬和脾后皮質(zhì)（RSC）中的基因表達,，這兩個腦區(qū)已知與學習和記憶有關(guān),。在這些實驗中，動物沒有習慣于恐懼條件反射箱,，相對于小鼠居住籠的反應代表了對編碼模塊,，而不是恐懼記憶本身,。訓練后對fos、arc和npas4誘導的時間過程的檢查表明,，兩個腦區(qū)的npas4 mRNA水平在1小時內(nèi)恢復到基線水平,，而fos和arc表達在較長時間內(nèi)保持升高。
這與Yingxi Lin實驗室的數(shù)據(jù)一致,，該數(shù)據(jù)顯示,，在cFC訓練后，這三個基因的結(jié)果相似,。此外,，他們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元中的急性npas4敲除阻止了fos、arc和zif268/egr1的誘導,，這表明npas4是活性依賴性基因誘導的主要調(diào)節(jié)因子,。
為了證明脾后皮質(zhì)中的IEG誘導是由cFC期間NMDA受體的激活誘導的，我們進行了實驗,，將小鼠暴露于NMDAR拮抗劑MK-801或賦形劑對照溶液中,。重要的是，盡管進行了大量的預處理,，但傳統(tǒng)的IEG如arc,、fos和egr1在注射后仍增加了表達，這可能是由于經(jīng)驗導致的,。
有趣的是,，載體注射后npas4沒有增加。所有IEG,，包括對cFC的反應,，都增加了它們的表達。用MK-801阻斷NMDAR可以部分阻止傳統(tǒng)IEG表達的增加,，而npas4的增加取決于NMDAR的激活,。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明npas4對載體注射激活的途徑?jīng)]有反應,。相反,，npas4對cFC有選擇性反應，并提供更高保真的突觸活動讀數(shù),。
上述數(shù)據(jù)充分表明,，傳統(tǒng)IEG對神經(jīng)元活動本身以外的信號有反應。另一個類似的發(fā)現(xiàn)來自對晝夜節(jié)律周期中IEG調(diào)節(jié)的研究,。有趣的是,，發(fā)現(xiàn)海馬體中傳統(tǒng)IEGs fos和arc的表達水平具有晝夜節(jié)律，在光暗周期內(nèi)一致波動，而npas4轉(zhuǎn)錄水平保持相對恒定,。
這些數(shù)據(jù)進一步支持了除對環(huán)境線索的急性神經(jīng)元活動反應之外的因素控制傳統(tǒng)IEG表達水平的觀點,。最后，鑒于npas4相對于fos和其他傳統(tǒng)IEG的調(diào)節(jié),，以及c-fos非常普遍用于標記被認為是“記憶痕跡"或“印跡"的活動依賴性神經(jīng)元集合的事實,，我們想確定npas4和fos是否標記了相同的神經(jīng)元群。為此,，我們進行了RNAScope原位雜交實驗，觀察cFC后的兩個轉(zhuǎn)錄本,。在海馬體的齒狀回區(qū)域,，發(fā)現(xiàn)了一個明顯重疊的最近激活的神經(jīng)元群。
然而,，在CA1區(qū),，我們看到不同神經(jīng)元群體的跡象可能用兩種不同的基因標記。這些數(shù)據(jù)是初步的,，不能用于得出明確的結(jié)論,，但它們確實明確提出了僅依靠c-Fos來識別最近激活的神經(jīng)元系綜的問題，尤其是最近將c-Fos表達等同于“印跡細胞"的趨勢,。
產(chǎn)品訂購：
神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白4（Npas4）,，也稱為Le PAS、NXF,、PASD10,、bHLHe79，是PER ARNT SIM（bHLH PAS）類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子中的一員,。Npas4由神經(jīng)元特異性即刻早期基因（IEG）Npas4編碼,，該基因受到神經(jīng)元活動的強烈誘導。與cfos等傳統(tǒng)IEG不同,，npas4對cAMP或神經(jīng)營養(yǎng)因子等旁分泌因子的刺激沒有反應（Lin等人,，2008）。此外,，Npas4表達比其他IEG更快速,、更短暫（Ramamoorthi等人，2011）,。這種對神經(jīng)元活動的緊密調(diào)節(jié)使Npas4成為大腦中神經(jīng)元活動的理想標志物,。
品牌 | Activity Signaling |
產(chǎn)品名稱 | Recombinant anti Npas4 Rabbit Mab |
貨號 | AS-AB18A-100/AS-AB18A-300 |
規(guī)格 | 100ul/300ul |
靈敏度/特異性 | 通過原代神經(jīng)元的免疫細胞化學、腦切片的免疫組織化學和蛋白質(zhì)印跡評估,，這種抗Npas4抗體具有最小的非特異性背景結(jié)合,。此外，npas4-KO小鼠的免疫反應性喪失,。小鼠睪丸的免疫反應性已經(jīng)得到證實,。未在其他物種中進行測試,。 |
抗體濃度 | 1mg/ml (無菌PBS),100ul |
產(chǎn)品應用 | 建議神經(jīng)元染色，免疫組化,、Western Blot工作濃度起始濃度1:500-1:2000,。最佳稀釋比根據(jù)實驗具體優(yōu)化確定。 |
產(chǎn)品保存 | 冰塊運輸,，短期4℃保存,，長期-20℃分裝凍存。 |
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