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Gibco特級胎牛血清使用方法

 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，經(jīng)常加入5%-20%的胎牛血清,，常使用的Gibco胎牛血 清濃度是10%。高濃度的血清可能改變細(xì)胞的基因表達(dá)譜,，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,，我們在實(shí)驗(yàn)中使用10%的Gibco南美 胎牛血清培養(yǎng)293T細(xì)胞,，效果非常好。但是有些細(xì)胞也會使用5%的Gibco FBS或者20%的Gibco胎牛血清,，要根據(jù)具體 細(xì)胞選擇合適的Gibco胎牛血清濃度,。

Gibco胎牛血清保存方法

1、需要長期保存的血清必須儲存于-20℃ - 70℃ 低溫冰箱中,。4℃冰箱中保存時間切勿超過1個月,。切勿將血清在 37℃放置太久,否則血清會變得渾濁,同時血清中的有效成分會被破壞，而影響血清質(zhì)量,。如果一次無法用完一瓶,可 將40～45ml分裝于無菌50ml離心管中,。由于血清結(jié)冰時體積會增加約10%,因此,血清在凍入低溫冰箱前，必須預(yù)留一 定體積空間,否則易發(fā)生污染或玻璃瓶凍裂,。
2,、一般廠商提供的血清為無菌,無需再過濾除菌。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物,則可將血清加入培養(yǎng)液內(nèi)一起過濾,切勿直接 過濾血清,。
3,、瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法:-20℃ 至 -70℃ 低溫冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天.然后移入室溫,待全 部溶解后再分裝,一般以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度 與成分均一,減少沈淀的發(fā)生,。.切勿直接將血清從-20℃進(jìn)入37℃解凍,這樣因溫度改變太大,容易造成蛋白質(zhì)凝集而 出現(xiàn)沉淀,。
4、熱滅活是指56℃, 30分鐘加熱已*解凍的血清.加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻.此熱處理的目的是使血清中的補(bǔ)體 成分滅活.除非必須,一般不建議作此熱處理,因?yàn)闊崽幚頃斐裳宄恋砦镲@著增多,而且還會影響血清的質(zhì)量.補(bǔ)體 參與反應(yīng)有:細(xì)胞毒作用, 平滑肌細(xì)胞收縮, 肥大細(xì)胞和血小板釋放組胺, 增強(qiáng)吞噬作用, 促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 發(fā)生化學(xué)趨化和活化,。
5,、血清中的沉淀物 絮狀物:主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成,這些絮狀物不會影響血清本身 的質(zhì)量.可用離心3000rpm,5分鐘去除,也可不用處理。 顯微鏡下"小黑點(diǎn)":經(jīng)過熱處理過的血清,沉淀物 的形成會顯著增多,。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象"小黑點(diǎn)",常誤認(rèn)為血清受污染,。一般情況下,此小黑 點(diǎn)不會影響細(xì)胞生長,但如果懷疑血清質(zhì)量,則應(yīng)立即停止使用,更換另一批號的血清。

Gibco胎牛血清使用中遇到的常見問題總結(jié)

一,、血清滅活問題,。

1、問：加到培養(yǎng)基中的血清必須滅活嗎,？

答：不是必須的,，看做什么實(shí)驗(yàn)了。

2,、問：Gibco胎牛血清滅活是56℃ 30分鐘嗎,？

答：如果用于培養(yǎng)大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞，血清一般是不需要滅活的,，這樣可以有效保存血清中的生長因子,。 但是如果用于培養(yǎng)一些表面具有補(bǔ)體受體的細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞,，血清是需要滅活,，一般是56℃,，30min。

3,、問：我要做滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng),，胎牛血清要滅活嗎？

答：進(jìn)口的一般都已滅活,，國產(chǎn)的不一定,，還是滅活一下再用較安全。

4,、問：我用病毒上清轉(zhuǎn)染細(xì)胞,，培養(yǎng)用的血清需要滅活嗎？因?yàn)檠逯锌赡苡行┭a(bǔ)體和抗體,，是不是會影 響轉(zhuǎn)染,？我想未滅活的血清中含些抗體補(bǔ)體可能會和病毒相結(jié)合，影響轉(zhuǎn)染,，正確嗎,？細(xì)胞是單核細(xì)胞白血病細(xì)胞， 病毒是病毒包裝細(xì)胞PT67收集的病毒上清,。為什么要用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時,，目的是什么？

答：血清一定要滅活,，可以先用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時以后再加血清,。避免雜蛋白對病毒和宿主 結(jié)合過程的干擾，一般是2-6小時,，根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)決定,。血清不一定需要滅活，滅活的目的是將血清中的補(bǔ)體滅活 ,！這要根據(jù)實(shí)際情況而定,，如果沒有把握那就滅活吧，也不麻煩56度半個小時,。

5,、問：(1)我買的是Gibco北美胎牛血清，要滅活嗎,？有些說法是需要,，有些說直接解凍后就可以加入到培 養(yǎng)基中；我配制胰蛋白酶液,，用的是D-PBS,，有關(guān)系嗎？

答：關(guān)于血清的熱滅活,，是很多人感興趣也存在一定爭議的話題,。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室將血清的熱滅活還是作為 常規(guī)來執(zhí)行,，因?yàn)橛袃蓚€作用，一是滅活補(bǔ)體,，第二是滅活血清中可能存在的支原體。但是實(shí)驗(yàn)者并沒有考慮熱處 理對血清中的生長因子,、氨基酸等成分帶來的負(fù)面影響,。

我在實(shí)驗(yàn)室處理血清的時候，有一次水浴箱在滅活過程中出現(xiàn)故障,，溫度升高到80℃,，血清變成了凝膠狀 ，我重新處理了另外一份血清,，將兩份血清對比,，發(fā)現(xiàn)高溫直接影響到血清所含的抗體蛋白。在56℃下滅活半小時以 上,，肯定也會對里面的蛋白起到破壞作用,。下次有機(jī)會我做個延長滅活時間的實(shí)驗(yàn)試試，看看到底有多大的影響,。熱 滅活之后,，血清放在四度冰箱久了，就會有沉淀產(chǎn)生,，這常常會被認(rèn)為是微生物污染或者是黑膠蟲污染,。為了驗(yàn)證到 底有沒有污染，常常又會把血清放置37℃溫育,，但是血清中的蛋白會進(jìn)一步析出,，還是要做鏡檢，無菌培養(yǎng)試驗(yàn) ,，和革蘭氏染色試驗(yàn),，非常麻煩。

我看過一份資料,，里面提到70%的實(shí)驗(yàn)者認(rèn)為滅活是理所當(dāng)然的,。常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間， 而時間則從15分鐘到60分鐘不等,。其中常用的手法是56℃熱處理30分鐘,。隨著血清采集、處理,、加工工藝的提高 ,，許多早先認(rèn)為是熱滅活的原因已經(jīng)不再成立，只有少數(shù)對血清進(jìn)行熱滅活的研究者在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這一步驟的有效 性和必要性,。有人比較過11個不同細(xì)胞株,，發(fā)現(xiàn)其中熱滅活對6 個細(xì)胞株(HBAE,，MDBK，Vero,，成纖維細(xì)胞,，MRC-5) 的生長帶來負(fù)面影響，三個細(xì)胞株(FOX-NY,，MDCK和CHO-K1)不受熱滅活的影響,，而只有兩個細(xì)胞株(Balb/3T3， Sp2/0Ag14 hybrid),，在熱滅活之后,，細(xì)胞生長有輕微的改善。所以,，在正常的操作下,，熱滅活通常對細(xì)胞的生長沒 有明顯的促進(jìn)作用。

你可以摸索一下,，血清從-20℃冰箱拿出來之后在常溫解凍,，然后混勻分裝成兩份，一份滅活,，一份不滅活 ,，比較這兩種血清對細(xì)胞是否有影響。然后再確定是滅活還是不滅活,。這個過程也就一個星期,。同時你還要考慮 血清滅活與否對你后續(xù)的實(shí)驗(yàn)有沒有影響。

問：(2)分裝后的血清從-20℃取出放4℃讓其液化,，卻見血清比較混濁,，有沉淀產(chǎn)生，這屬正常嗎,？

答：正常,。

二、血清的保存問題,。

1,、問：2016年6月到期的GIBCO胎牛血清到2017年5月還能用嗎？

答：只有試試了,，如果一直在-20℃凍著來者,，應(yīng)該還可以，先少用點(diǎn)看看,。養(yǎng)細(xì)胞系應(yīng)該沒問題,，原代不行。

2、問：請問我自然溶化好的胎牛血清和1640培養(yǎng)基今天用不上,，明天用,，我不想放到冰箱里，放在室溫下 一晚行嗎,？100毫升培養(yǎng)瓶加多少培養(yǎng)基呢,？

答：可以放4℃。4-5ml,。

3,、問：4℃冰箱內(nèi)保存3個月的胎牛血清，能否繼續(xù)使用,？相關(guān)細(xì)胞和其它試劑的代價(jià)比較高，不敢輕易嘗試,。

答：需要長期保存的Gibco胎牛血清必須要保存在-20至-70℃的低溫冰箱中,，4℃冰箱中保存時間不要超過1個月。

三,、血清滅活時溫度問題,。

1、問：因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室水浴鍋失控,，血清滅活時,，溫度到了61.7℃，這血清還能用嗎,？

答：多長時間?。慷虝r間應(yīng)該可以吧,，我有一次加熱了一個多小時,，還照樣用。

2,、問：我滅活胎牛血清時,，用的電磁爐，定在了70℃,，本來說調(diào)溫度到56℃再放血清的,，后來忘了，就把 血清放進(jìn)去了,，所以滅活的溫度肯定超過56℃了,，不知道這樣對血清有沒有影響？

 答：常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間,，而時間則從15分鐘到60分鐘不等,，其中常用的手法是56℃ 熱處理30分鐘。看看你養(yǎng)的細(xì)胞是什么,，一般的話估計(jì)問題不大,，要是很珍貴的細(xì)胞還是慎重一點(diǎn)啊。熱滅活目的是 為了去除血清中補(bǔ)體等對熱敏感的物質(zhì),， 在對補(bǔ)體滅活以外,，熱處理同時也對血清中可能存在的支原體具有滅活作 用。現(xiàn)在好像不主張熱滅活,，熱滅活經(jīng)常給血清產(chǎn)品帶來負(fù)面影響,，對血清的加熱經(jīng)常導(dǎo)致血清中沉淀的產(chǎn)生，此外 ,，有研究結(jié)果證實(shí)熱滅活步驟減弱了胎牛血清和小牛血清對細(xì)胞的促粘附作用,。

四、FBS可否代替人AB型血清,？

問：我現(xiàn)在在做人的外周血b淋巴細(xì)胞的培養(yǎng),，文獻(xiàn)上要求用人的AB型血清，但是我覺得很多代理商都沒有 ,。我想FBS代替,，但不知道可否，我先是擔(dān)心免疫排斥之類,，但是我查了些資料后,，應(yīng)該不會(我覺得)。但是我又不 能夠TRY,。因?yàn)榧?xì)胞因子確實(shí)太貴了,，所以咨詢一下。謝謝,！

答：你還是照文獻(xiàn)的做,。除非你系列實(shí)驗(yàn)證明你用代用品的結(jié)果與文獻(xiàn)的相同(你還是要用到文獻(xiàn)的試劑) 。細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素很多,，特別是培養(yǎng)基的成分,。

五、血清的制備方法問題,。

1,、問：我的實(shí)驗(yàn)需要自己制備一些血清用于培養(yǎng)細(xì)胞，有沒有人知道用于培養(yǎng)細(xì)胞的血清需要怎樣的制備 過程,？

答：自己制備血清當(dāng)心污染啊,。如果無菌條件好的話，用靜置析出方法就行,。

2,、問：一般我們用得胎牛血清用前還要滅活,，我想用大鼠的血，不知道要不要滅活,？

答：你直接把采來的血液在離心管里4℃過夜,，離心，取上清,，在無菌過濾,，也可滅活，然后分裝凍存,，用 時再配,。

3、問：如果滅活會不會對血清中的一些因子有損傷,？

答：加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng),。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮,，細(xì)胞和血小板釋放組胺,， 激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究,、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時,，推薦使用熱滅活血清,。滅活 一般不會對血清中的一些因子損傷的。

六,、心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)時血清的使用問題,。

1、問：在進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)時,，需要用含血清的培養(yǎng)基中止胰酶的消化作用,，我現(xiàn)在使用的是含血清 10%的培養(yǎng)液，但近日看北醫(yī)一個細(xì)胞培養(yǎng)的課件發(fā)現(xiàn),，有用1%血清培養(yǎng)液進(jìn)行中止消化的,，想問一下，1%的是否可 以,，效果是否有保證,？這樣確實(shí)能節(jié)省不少血清的。

答：關(guān)于心肌細(xì)胞元代培養(yǎng)的FBS問題：

(1)1%的血清*培養(yǎng)基可不可以,，得看你胰酶的用量,。但是在心肌細(xì)胞元代培養(yǎng)就不行。 10%的FBS* 培養(yǎng)基效果都不太好,，開始心肌細(xì)胞元代培養(yǎng)需要高濃度的FBS,，20%左右，但這就有出現(xiàn)另一個問題，在FBS*培 養(yǎng)基中,，成纖維細(xì)胞呈優(yōu)勢細(xì)胞,，須得在培養(yǎng)基加入適量的BrdU以抑制其生長，純化心肌細(xì)胞,。

(2)FBS的作用不僅僅是拿來中和胰酶,，只是FBS中的一些蛋白質(zhì)如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用 。

(3)元代心肌細(xì)胞培養(yǎng)的FBS使用,，有講究：剛開始使用20%左右的高濃度的FBS,，后逐漸遞減為無血清的 DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2,、問：我胰酶的用量是0.08% ,，并混和了0.08%的膠原酶。FBS要高濃度遞減是否是說的在細(xì)胞培養(yǎng)中啊,， 難道在消化時終止也需要如此高的濃度嗎,，還有，我的BRDU只用到48小時就不用了,，因?yàn)閾?dān)心其損傷太大,，可以持續(xù) 用多久呢？

答：我用10%FBS終止的,，然后差速1h,，然后還是用10%FBS的HG-dmem養(yǎng)的，沒有用brdu,，心肌細(xì)胞還是比 較多和穩(wěn)定的,，我第3天就可以用，第2天晚上看就會有搏動,。

七,、血清和培養(yǎng)基的種類及品牌問題。

1,、問：細(xì)胞培養(yǎng)的胎牛血清用哪個公司的產(chǎn)品比較好呢,？周圍有人用PAA或Hyclone的，這兩種跟Gibco或 sigma出品的差別大嗎,？

答：如果是長得非?？斓眉?xì)胞如pa317，293,，c6等惡性腫瘤細(xì)胞,，一般得國產(chǎn)血清就可以，如果是原代培養(yǎng)的細(xì)胞,，還是應(yīng)用胎牛血清或類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清,，Hyclone公司血清的質(zhì)量不如GIBCO(同類血清),。國產(chǎn)的杭州四季 青和甘肅民海（中美和資）不錯。有些細(xì)胞(如：sf9,，293還有其他一些元代細(xì)胞),，用Gibco的比其他兩種好很多， 會大大加速試驗(yàn)進(jìn)度,。對于其他一些細(xì)胞(如：vero,，MDCK，pk)四季青,，Hyclone的小牛血清足矣,！另外，Gibco的 還要看產(chǎn)地,。

2,、問：近期要訂一瓶胎牛血清，實(shí)驗(yàn)室之前都在用小牛血清,，沒有買過胎牛血清,。請問哪個公司的好一些 ？問過試劑公司,，有兩種：一種是PAA的(分普通級和優(yōu)級),，一種是Hyclone的(只有普通級，而且是新西蘭產(chǎn)的),。 試劑公司推薦使用PAA優(yōu)級的,，但看好多文獻(xiàn)都用Hyclone的，公司說是因?yàn)楝F(xiàn)在Hyclone的都不是美國進(jìn)口的了,。請 問用的哪種胎牛血清比較好？

答：民海的效果還不錯,，要是不放心國產(chǎn)的,，那就買進(jìn)口的。進(jìn)口的好多公司都有,，新西蘭產(chǎn)的效果一般 ,。Hyclone和Gibco的都還可以。民海的似乎比四季青的要好些,。復(fù)蒙的感覺也不錯,。

3、問：四季青“無噬菌體,、低內(nèi)毒素胎牛血清”與“無支原體胎牛血清”的區(qū)別 ,？培養(yǎng)腫瘤傳代細(xì)胞用哪一個比較好些？

答：用無支原體胎牛血清就可以啦,。

4,、問：SKBR-3細(xì)胞培養(yǎng)用哪種型號的1640培養(yǎng)基及胎牛血清,？

答：我一直用GIBCO的1640，你可以買含HEPES的1*10L的包裝,，胎牛血清也是用的GIBCO,，10%就行。 

八,、牛血清污染噬菌體的問題,。

1、問：有誰知道小牛血清制造過程中怎樣能夠避免噬菌體的污染,，以及對已污染噬菌體的牛血清怎樣能夠 除去噬菌體,？

2、問：我也想知道,，我用的血清中大部分都有噬菌體,，它對細(xì)胞培養(yǎng)到底有什么影響？

暫無回答,。

九,、培養(yǎng)基血清濃度問題。

問：在1640里加血清時加多了,，90ml里加了20ml血清,，約為18%，以前都是加10ml的,，查了網(wǎng)上多建議用 10%-15%,，有關(guān)系嗎？

答：我認(rèn)為一般來說血清濃度的較大波動對細(xì)胞的狀態(tài)影響較大,，建議再加90ml1640調(diào)成10%,。血清濃度大 當(dāng)然細(xì)胞狀態(tài)感覺要好，但是高濃度的血清可能改變細(xì)胞的基因表達(dá)譜,，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,。10%的濃度培養(yǎng)鼻煙 癌細(xì)胞很好。

十,、問：MTT加藥的時候加不加血清,？加藥時要用無血清的培養(yǎng)基嗎？

答：我的藥就是用含血清的培養(yǎng)基稀釋的,，不含血清的培養(yǎng)基對細(xì)胞有毒性或抑制作用,，無形中對細(xì)胞造 了一個serum-free的模型，細(xì)胞在提內(nèi)本來就是有血清供應(yīng),，如果該藥物都不能對抗,，那該藥物就沒有什么臨床價(jià) 值了，這是我的理解,。

十一,、PC12細(xì)胞培養(yǎng)所用血清問題,。

問：我正準(zhǔn)備購買上海細(xì)胞所的未分化的PC12細(xì)胞，需要滅活的馬血清,，可現(xiàn)在買血清很困難,，好像是海關(guān)有封鎖，代理商這么說的,，我原定購買的Gibco的horse surum,，現(xiàn)在無法買到了，好容易找到一個目前可以進(jìn)血清的公司Hyclone,，有一種Donor Equine serum是馬血清嗎,？

答：Hyclone的Donor Equine serum可以用，我以前用的就是這個,。,。

十二、AB血清的制備問題,。

問：本人想從人的外周血中分離AB血清的,，用于B淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)。謝謝大家給點(diǎn)建議,。人的血,，來之不易啊。

答：是AB血型人的血清嗎,？這種血清即沒有抗A型抗原抗體,，也沒有抗B型抗原抗體。分離血清時將采集的 血液注入試管中,，待血液凝固后離心分離血清,。可將采集的血液放在37℃水浴箱中促進(jìn)血液凝固,，減少凝固時間,。離 心可在2500～3000rpm，10min,，足可以分離血清。分離后將血清吸出保存即可,。分離血清的量可按采集血液的50%左 右計(jì)算,，因?yàn)榧t細(xì)胞占總血液的50%左右。當(dāng)然整個過程要注意無菌操作,。

十三,、Gibico的胎牛血清內(nèi)是否含糖？

問：我想做糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的試驗(yàn),。細(xì)胞培養(yǎng)液里加入了20%的胎牛血清,。因此胎牛血清里是否含有糖對我 實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)液糖終濃度影響比較大,。今天打電話問GIBCO公司的技術(shù)顧問，回答我糖濃度少于5μg/ml,，因此基本 可認(rèn)為是不含糖,。但我今天把胎牛血清送到我們醫(yī)院檢液科，結(jié)果卻是：6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法),。難道是檢 測人血清的血糖濃度的方法不能用于檢查牛血清嗎,？(另起茶水驗(yàn)?zāi)蚴录?/span>)檢驗(yàn)科沒有給我回答。

答：應(yīng)該是不含糖的,。請參照gibco的網(wǎng)站： 第五頁我做了個記號,。直接點(diǎn)擊鏈接就可以看到它的說明書頁面。我想我們肯定要以公司的說明書為準(zhǔn),。至于為什么檢驗(yàn)科測起來有誤差,，我想 可能是樣本不一樣，需要用標(biāo)志品矯正有關(guān),。具體需要檢驗(yàn)科的戰(zhàn)友解釋了,。

十四、血清或培養(yǎng)基產(chǎn)生了顏色或沉淀的問題：

1,、問：我用的是四季青的胎牛血清,，56℃30分鐘滅活后出現(xiàn)了白色少量絮狀沉淀，是不是污染,？還能不能 再用,？血清的生產(chǎn)日期是2006年7月(現(xiàn)在是2007年6月11日)。

答：應(yīng)該問題不大,。你可以取少量血清放入培養(yǎng)皿中,，37℃過夜培養(yǎng)看看就知道是否污染了。血清中沉淀 物的出現(xiàn)有許多種原因,，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在 血渭解凍后，也會存在于血清中,，亦是造成沉淀物的主要原因之一,。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量,。 若您欲去除這些絮狀沉淀物,，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心,，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起 過濾,。

2、問：我用MTT法測細(xì)胞的增殖，用DMSO裂解細(xì)胞,，發(fā)現(xiàn)把DMSO加入到孔中就會形成乳白色(用的含胎牛血 清的1640培養(yǎng)基,，由于沒有離板子的離心機(jī)，所以沒有去除培養(yǎng)基直接加的DMSO),。以前用含小牛血清的培養(yǎng)基沒有 看到有這種情況,。該怎么解決？

答：為什么要用離心機(jī)離心呢,？難倒你養(yǎng)的是懸浮細(xì)胞嗎,？如果是貼壁細(xì)胞的話直接將MTT倒掉，再加DMSO 即可,，我們就是這么做的,，效果很好！并且測細(xì)胞的增殖的話如果不去掉MTT就加DMSO的話誤差應(yīng)該很大,！有時不一 定就是血清的原因,，可能跟你的MTT放置的時間或以及其他成分有關(guān)！

3,、問：(1)GIBCO胎牛血清500ml,，今天解凍后沒有混勻直接分裝，結(jié)果使得前面的幾管是清亮的,，后面就 帶有棕色的,，不知有沒有影響？估計(jì)有什么影響,？前面的成分好還是棕色的成分好?。?/span>

答：肯定有,。還是重新混合重新分裝,，我覺得有效成分會集中在棕顏色部分。

問：(2)為什么會出現(xiàn)棕色呢,？

答：血清中的棕色多一些可能是因?yàn)榧t蛋白的含量高些的緣故吧,。

問：(3)血清滅活之后可以存放嗎？我的是前天滅活的,，但是沒有加到培養(yǎng)基里,，而是放在冰箱里，那下次 可以直接用嗎,？還是再次滅活?。?/span>

答：當(dāng)然可以,，如果多的話,，分裝后放在－20℃,，下次用時再解凍,，也不用再滅活,。用一管拿一 管，少許血清可以放在4℃,。分裝時還要注意不要裝得太滿,，以免溢出污染。

十五,、污染和過濾的問題,。

1、問：懷疑血清染菌,，想用濾膜過濾一下,，可否自己用0.22μm濾膜過濾？對血清性質(zhì)有多大影響,？有 做過的么,？

答：可以過濾的，血清當(dāng)出廠時都是0.22μm或0.1μm過濾除菌,。想證明有沒有染菌不用過濾這么麻煩 ,，只要放置于37℃過夜就可以了，如果有微生物污染會變渾濁的,，如果還是澄清的就說明沒有問題的,。實(shí)驗(yàn)室中血清 很難直接過濾，一般要加到培養(yǎng)基中再過濾,。我們實(shí)驗(yàn)室制備培養(yǎng)基時,，都使用濾膜過濾，一般而言如果制備1-2瓶 培養(yǎng)基,，一個濾膜及一支30ml注射器可以過濾50ml小牛血清,。如果大量制備培養(yǎng)基也可以將血清加到培養(yǎng)基中，使 用0.22微米的大濾膜一起過濾,。

2,、問：我懷疑我用的*1640培養(yǎng)液被污染了，準(zhǔn)備重新過濾消毒,，過濾后是否需要補(bǔ)充胎牛血清,？如需 又如何補(bǔ)充？

答：*1640培養(yǎng)液被污染了,，如果是支原體的話,，過濾沒有作用，支原體可以通過濾膜,。我們用1640液 ,，都是配液后保留500ml，然后其他的分裝100-200ml，現(xiàn)用現(xiàn)配因?yàn)檠灞?/span>1640要貴,，如果你想過濾的話,，建議你加原比例血清，因?yàn)檠宀粫苋菀淄ㄟ^濾膜,。主要的還是找到可能污染的原因,。

3、問：加好了血清雙抗的培養(yǎng)基由于污染了再過濾后還能用嗎,？

答：建議不要用了,。在加了雙抗的情況下已經(jīng)污染，那么細(xì)菌污染的可能性會較小了,。一般的過濾除不能 去除病毒或者部分真菌的污染的,。

4、問：我準(zhǔn)備把使用的*1640培養(yǎng)液重新過濾一遍,，不知道培養(yǎng)液中的血清成分是否能通過濾膜,，過濾 后是否還需要補(bǔ)充胎牛血清？如需又如何補(bǔ)充,？

答：可以透過,，但是隨著液體量的增多會很慢，如果不加壓會比較麻煩,，還有用低蛋白吸附的,，不然損失是比較大的。

十六,、問：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時能否加血清,？如果加了會有什么結(jié)果？為什么懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時就不能加血清,？

答：血清是細(xì)胞培養(yǎng)基中重要的培養(yǎng)成份之一,，對細(xì)胞生長有廣泛影響。在細(xì)胞培養(yǎng)時,，我們通常會加入 10%的血清,。血清的質(zhì)量對細(xì)胞培養(yǎng)的成功至關(guān)重要。一般說來,，牛血清包括以下成分：生長因子(如激素,，白細(xì)胞介 素等)，他們可以促進(jìn)細(xì)胞生長,；貼附因子,，他們可以促進(jìn)細(xì)胞的貼壁，往往只有細(xì)胞貼壁才能增值(懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞 除外),；蛋白質(zhì)(如血清白蛋白,，球蛋白等),，既可以作為營養(yǎng)物質(zhì)，又可以中止胰酶的作用,；還有很多成分不明的物 質(zhì),。血清還可以起到解毒作用，如脂肪酸,、重金屬和某些蛋白酶的毒性。血清還可以是細(xì)胞免受機(jī)械損傷,。因此,，無 論是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞，血清是*的,。除非因?qū)嶒?yàn)要求無血清培養(yǎng)時,，例如：為使細(xì)胞同步化時，我們會 采用無血清培養(yǎng)的,。單純的說懸浮細(xì)胞培養(yǎng)不能加血清就沒有太多的道理了,。

十七、關(guān)于中和消化液需要的血清量。

問：用胰蛋白酶消化細(xì)胞后，需要用血清中和,。具體這種中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之間的比例是 多少,？

答：做了很久的試驗(yàn)，真的沒有想過胰酶和血清的對應(yīng)關(guān)系,。不過細(xì)想下來，這個應(yīng)該也沒有固定的比值 。血清的品種都是不同的,，成分必然有差異，如何能確定其與胰酶的比值關(guān)系,？我們消化細(xì)胞的時候,，如果是傳代， 細(xì)胞變形后,，吸出胰酶直接加入適量的hanks液或者全培,，這個量看自己的喜好和吹打細(xì)胞方便而定。一般都可以中 止消化的,。不會存在繼續(xù)消化的事情,。如果是從組織上消化細(xì)胞做原代培養(yǎng)，我一般都使用全培進(jìn)行中止,，而且加的 很多,，0.25%的胰酶，用10%血清,，按1:2的比例應(yīng)該是足夠的,。當(dāng)然全培是2,，一般我養(yǎng)細(xì)胞的時候，會用國產(chǎn)的比 較便宜的血清配制全培,，專門用于中止消化,，這樣有幾個好處：一是中止消化的效果應(yīng)該好于hanks液吧，再是也有 利于維持細(xì)胞活性,。而且這部分液體會被離心去掉,，血清便宜，離心掉了不會心疼,。而養(yǎng)細(xì)胞的時候用好血清,。個人 觀點(diǎn)，僅供參考,。

十八,、血清中的懸浮物問題。

1,、問：發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞瓶中背景有許多的小黑點(diǎn),，培養(yǎng)液中也有一些漂浮的物?？戳酥暗奶詾槭悄z原 蟲,。本打算換液，換液前特意看了下前些天配的培養(yǎng)液,，肉眼發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中有懸浮的顆粒狀物質(zhì)(不多),，于是放在鏡 下觀察，新鮮培養(yǎng)液中有一些懸浮的小顆粒,，不多,。(培養(yǎng)液是R1640+20%牛血清+1%雙抗)于是又將分裝在4℃保存的 小牛血清拿出觀察，肉眼可見5,、6個白色小小球狀的物質(zhì),，在血清瓶稍靠下的部位懸浮。鏡下觀察,，也有少量的不知 什么物質(zhì)的東西漂浮,。小牛血清是Hyclone新西蘭的，標(biāo)簽上寫已經(jīng)經(jīng)過2μm濾膜過濾處理,。根據(jù)上述培養(yǎng)液的情 況,，是否說明培養(yǎng)液已被污染？如果是正常的血清是不是在鏡下不應(yīng)該看到雜物,，哪怕是極少量的,？根據(jù)上述血清的 描述，是不是說明血清也存在問題,，還能用嗎,？補(bǔ)充：細(xì)胞培養(yǎng)以來生長狀態(tài)就不好,。買血清的時候廠家說明不用滅 活，所以未滅活,。

答：(1)血清應(yīng)該-20℃保存,，解凍血清時，請按照的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫),，若血清解凍時改變 的溫度太大實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物,。

(2)血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,，而血纖維蛋白 在血清解凍后,，也會存在于血清中，亦可造成沉淀物,。

(3)若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清,，再放回冷凍,，若存放于4℃時，請勿超過一個月,，儲存 在2－8℃時,，血清中的各種蛋白和脂蛋白，可能聚集而形成沉淀或可見的混濁,。

(4)解凍血清時,，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一,，減少沉淀的發(fā)生,。

(5)排出了血清的原因，在考慮實(shí)驗(yàn)用品和無菌操作的問題,。

(6)細(xì)菌病毒,、衣原體、黑膠蟲污染也很常見,，如果細(xì)胞死的太多,，影響較大建議更換培養(yǎng)液。

2,、問：今天在配培養(yǎng)液時,，發(fā)現(xiàn)血清里面有小碎片樣的漂浮物，血清仍然清亮,，不渾濁,。不知道是什么， 問了實(shí)驗(yàn)室的學(xué)長,，說仍然可以用,，但還是不放心,，沒有用血清。求助園子的各位達(dá)人,，這可能是血清出了什么問題 ,？我的血清用了一個月不到，四季青的,。

答：可能的原因：(1)培養(yǎng)液配置時Votex不夠,，當(dāng)時是清亮的，但過一段時間會析出來,；(2)真菌污染,。

十九、更換無血清培養(yǎng)基后細(xì)胞大量死亡的問題,。

問：我使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞,，在轉(zhuǎn)染前要換上無血清的培養(yǎng)基。本來?xiàng)l件模的好好的,，轉(zhuǎn) 染效率也可以接受,。但是寒假一回來就發(fā)生了怪事：細(xì)胞在有血清的培養(yǎng)基中長的好好的，一換無血清的培養(yǎng)基就死 亡,。大概4個小時就能看到較多的細(xì)胞飄起來,。但是原來我換無血清培養(yǎng)基，就算放那里10個小時都是沒問題的啊,。 已經(jīng)換了不同批次的培養(yǎng)基,，甚至吸管什么的都換過了，但是就是不行,，是怎么回事,？

答：(1)兩周后的培養(yǎng)液應(yīng)補(bǔ)加谷氨酰胺，或者重新配液,，轉(zhuǎn)染時應(yīng)不含抗生素,。

(2)確認(rèn)操作方法和環(huán)境，建議檢查一下,。

(3)Lipofectamine2000,，脂質(zhì)體的毒性很大，如果有質(zhì)粒參與對細(xì)胞損傷更大,，如果Lipofectamine2000 在常溫放置過,，對細(xì)胞更大，假期冰箱是否斷過電,。

(4)培養(yǎng)箱的溫度,、c02濃度，濕度,。

二十,、*培養(yǎng)液的相關(guān)定義,。

問：“*培養(yǎng)液一詞”，是指加了血清的培養(yǎng)液嗎,？我在做含藥血清的實(shí)驗(yàn),，涉及到血清添 加量的問題。所以想弄明白文中所指的“*培養(yǎng)液”是否是含藥血清,。

答：原液是指配置后過濾除菌,。不*培養(yǎng)液是指不含有血清的原液，其他成分已補(bǔ)充,。*培養(yǎng)液是指 不*培養(yǎng)液加入血清后稱*培養(yǎng)液,。

二十一、血清相關(guān)知識總結(jié),。

使用胎牛血清的注意事項(xiàng)：

血清是細(xì)胞培養(yǎng)中重要的元素之一,。下面是實(shí)驗(yàn)室里常會遇到的問題，僅供大家參考：

1,、保存血清的方法：

建議血清應(yīng)保存在-5℃ 至 -2O ℃ ,。然而，若存放于 4 ℃ 時,，請勿超過一個月,。若您一次無法用完一瓶 ,，建議您無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi),，再放回冷凍。

2,、如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損：

建議您將血清從冷凍箱取出后,，先置于2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室溫下使之全溶,。但必須注意的是,， 溶解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。

3,、血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn),，該如何處理：

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,，而血纖維蛋白(形成 凝血的蛋白之一)在血渭解凍后,，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一,。但這些絮狀沉淀物,，并不影 響血清本身的質(zhì)量。

若您欲去除這些絮狀沉淀物,，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi),，以400g稍微離心,，上清液即可接著加入培 養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物,，因?yàn)樗赡軙枞倪^濾膜,。

4、何謂熱滅活：

一般是以 56℃ ,， 30 分鐘來處理已解凍的血清,，因?yàn)榇思訜岵襟E，可以使補(bǔ)體去活化,，而補(bǔ)體所參與的 反應(yīng)有 : 溶細(xì)胞活性,，平滑肌的收縮，肥大細(xì)胞和血小板組胺的釋放,，增強(qiáng)吞噬作用,，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的趨化 和激活,。

5,、關(guān)于胎牛血清的滅活：

有必要做熱滅活嗎？

實(shí)驗(yàn)顯示,，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清,，對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生 長只有微小的促進(jìn),，或*沒有任何作用,，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低,。 而經(jīng)過熱處理的血清,，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒立顯微鏡下觀察,，像是“小黑點(diǎn)” ,，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 環(huán)境中,，又會使此沉淀物更增多,，使研究者誤認(rèn)為是 微生物的分裂擴(kuò)增。

因此我們建議您,，若非必須,，您可以不需要做熱處理這一步。如此一來,，不但節(jié)省您寶貴的時間,，更確保 您血清的質(zhì)量！

6、血清相關(guān)知識：

如何避免沉淀物的產(chǎn)生,？

我們建議您在使用血清的時候,，注意下列的操作 :

(1)解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-2O℃至4℃至室溫),，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃ 至37℃),，實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。

(2)解凍血清時,，請隨時將之搖晃均勻,，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生,。

(3)請勿將血清置于37℃太久,。若在37℃放置太久，血清會變得混濁,，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會 因此受到損害,，而影響血清的質(zhì)量。

(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,，若非必要,，可以無須做此步驟。

(5)若必須做血清的熱滅活,，請遵守56℃,，30 分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻,。溫度過高,，時間過久或搖 晃不均勻，都會造成沉淀物的增多,。