FD Rapid GolgiStainTM Kit FD 快速高爾基染色試劑盒
神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)研究的完整 Golgi-Cox 染色試劑盒
使用手冊中文版
PK401/PK401A
I. 介紹
Golgi-Cox 浸染法是研究神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞正常和非正常形態(tài)zui有效的方法之一,。 使用 Golgi 技術(shù),，在藥物處理過的動物腦中和因神經(jīng)疾病死亡的病人腦中發(fā)現(xiàn)了神經(jīng) 樹突和樹突微小的形態(tài)改變。然而 Golgi 染色法的不可靠性且費時已成為這種方法廣泛應(yīng)用的障礙,。
FD Rapid GolgiStainTM Kit(FD 快速高爾基染色法)是根據(jù) Ramón-Moliner,，Glaser 和 Van der Loos 所闡述的方法原理設(shè)計的。該試劑盒不僅極大地改進并簡化了 Golgi-Cox 技術(shù),，而且被證實在顯示神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞,，尤其是樹突棘的形態(tài)細節(jié)極為靈敏 可靠,。北京博蕾德生物代理的 FD Rapid GolgiStainTM Kit 已被廣泛用于并用于數(shù)種動 物腦組織染色。
II. 試劑盒盒組分
PK401A | PK401 | |
溶液 A | 125 ml | 250 ml |
溶液 B | 125 ml | 250 ml |
溶液 C | 125 ml x 2 | 250 ml x 2 |
溶液 D | 125 ml | 250 ml |
溶液 E | 125 ml | 250 ml |
琉璃樣品回收器 | 2 | 2 |
天然毛畫筆 | 2 | 2 |
滴瓶 | 1 | 1 |
塑料鑷子 | 1 | 1 |
使用手冊 | 1 | 1 |
III. 需要但未包括在試劑盒里的物品
1. 雙蒸水或 Milli-Q 水
2. 塑料/玻璃管或瓶
3. 組織學(xué)耗材： 明膠包被的顯微鏡載玻片（Cat.#PO101） 蓋玻片
染色罐 乙醇 二甲苯
樹膠封片劑 Permount®
光學(xué)顯微鏡
IV. 安全操作注意事項
1. FD Rapid GolgiStainTM Kit 僅用于體外研究,，不能用于診斷或其它應(yīng)用。
2. 試劑盒所包含有試劑是有毒的，吸入或接觸皮膚是有害的,，如果吞咽可能是致 命的,。不要用嘴吸,。避免吸入和接觸皮膚和眼睛,。如果接觸,，立即用大量的水 沖洗并求助醫(yī)生,。
3. 在化學(xué)通風(fēng)櫥下完成實驗。操作這些試劑時須穿戴合適的防護服,，手套和眼睛 和面部防護罩,，完成實驗之后把手*沖洗干凈。
V. 組織制備
使用此試劑盒前必須仔細閱讀以下說明！,！
l 所用容器（zui好為塑料材質(zhì)）必須用蒸餾水沖洗干凈,。
l 當(dāng)溶液 A 和溶液 B 存在時不能使用金屬器具,。
l 保持容器密封,。
l 用溶液 A 和溶液 B 處理的組織和切片，應(yīng)該避光,。
l 除非特別指出,，以下流程需在室溫下完成,。
1. 殺死動物之前對實驗動物進行深度麻醉。應(yīng)盡快地從顱骨中取出動物的腦（或病人的腦）,，但操作時必須非常小心以免損傷或壓迫組織。
注意
l 除非*必要,，不要對動物進行灌注,。如果確實需要對動物進行灌注（用4%的多聚甲醛處理不要超過 5 分鐘），一定不要對組織進行后固定處理。
l 體積較大的腦部樣本包括大鼠腦部應(yīng)該用鋒利的刀片切成大約 10mm 厚的 塊狀,。
重要提示,！
2. 用雙蒸水或 Milli-Q 水快速沖掉組織表面的血液,。
3. 把組織浸泡在由溶液 A 和 B 等體積混合的浸漬液中,，室溫下黑暗保存兩周*。浸 泡 6 個小時以后或次日更換新的浸漬液,。
*對于大多數(shù)情況浸泡 2 周是足夠的,。然而，不同的組織類型及組織的大小不同 可能需要延長或縮短浸泡時間來達到zui佳效果,。對于每種類型的組織的浸泡時 間應(yīng)該通過試驗獲得,，但是對于大多數(shù)組織浸泡 3 周是足夠的。注意,，延長浸 泡時間可能增加染色背景
注意
l 溶液 A 和溶液 B 的混合液至少在用之前 24 小時配制,，并不能攪拌,。
l 采用以上方案則不會產(chǎn)生沉淀是關(guān)鍵的,。
l 制備好的浸泡液在用之前室溫黑暗保存可長達一個月。
l 每 m3 待研究組織至少用 5ml 浸泡液,。注意用較少的浸泡液可能降低染色 的靈敏性和可靠性,。
l 為取得zui佳結(jié)果，在浸泡期間每周兩次對裝有組織的容器可輕輕地左右旋 渦（一定不要晃動！）幾秒鐘溶液 A 和 B （含有升Hg,，重鉻酸鉀和鉻酸鉀）接觸皮膚是有毒的,，如果吞 咽可能是致命的,。實驗應(yīng)該在化學(xué)通風(fēng)櫥中完成。當(dāng)操作這些試劑時應(yīng)穿 戴防護服，手套和防護面具/眼鏡,。不要把溶液 A 和 B 的廢棄物倒進水槽中！ 把溶液 A 和 B 的廢棄物收集起來放到一個瓶子中,，致電安全辦公室或有執(zhí) 照的專業(yè)廢物處理服務(wù)的部門處理些材料。
4. 轉(zhuǎn)移組織到溶液 C 中室溫黑暗至少 72 小時（可長達 1 周）,。24 小時后或次日至 少更換一次溶液,。
5. 在-20℃到-22℃的條件下用冷凍切片機將組織切成 100-200 um 厚的薄片（進行切片之前請仔細閱讀第 4 和 5 頁的信息）。也可用其它型號的顯微鏡薄片切片機包括滑動切片機和振動切片機（具體細節(jié)參看第 4 和 5 頁）,。用樣本回收器（試 劑盒提供）把樣本轉(zhuǎn)移到含有溶液 C（試劑盒所提供的滴瓶是方便溶液 C 滴到載 玻片上）的明膠包被的顯微鏡載玻片上（Cat#PO101）,。載玻片上多余的溶液用 吸管吸走并用濾紙吸干（載玻片上的溶液必須盡可能地吸干否則切片將從載玻 片上脫落下來）。切片可以室溫下自然風(fēng)干（不能用電風(fēng)扇或電熱板使其干燥）,。 為取得zui佳結(jié)果,，應(yīng)盡快地完成切片，制備好的切片如果保存于載玻片盒中,， 室溫黑暗條件下zui長可保存 3 天,。
注意
l 為避免組織受冷凍切片機的損害，并盡可能地保持細胞形態(tài)學(xué),，組織在進 行冷凍切片之前應(yīng)快速冰凍,。比如，組織應(yīng)按以下描述盡可能地快速冰凍： 把組織放在一個塑料匙中慢慢地浸入含有干冰的異戊烷中預(yù)冷（為取得zui 佳結(jié)果,，溫度應(yīng)保持在-70℃以下并且浸入過程用時 1 分鐘,，越慢越好）。組織*浸入異戊烷之后,，使組織在異戊烷中浸幾秒鐘,，然后再放置干冰上 1分鐘以確保組織能很好地冰凍。進行切片之前不要讓組織融化,。
l 切片機的型號可能會有不同,，但所用的型號確保能切厚的切片（比如 100 um）。
l 如果冰凍切片機只有一個溫度設(shè)置,，那么在進行切片之前把溫度設(shè)置在-22℃ 至少 4 個小時,。如果有兩個溫度設(shè)置,，那么設(shè)置槽內(nèi)溫度比樣本溫度低 1℃。 請注意大多數(shù)情況下-22℃是zui佳的溫度,，然而,，為了更順利地切出切片并 沒有破碎，不同型號的切片機和不同的組織可能需要更高或更低的槽內(nèi)溫 度,。
l 對于用冰凍切片機切片,，以下幾點提示是有益的：1）用蒸餾水把組織固定 于樣本盤上，但必須確保組織沒有融化（可以在干冰上完成）,。組織可以被 固定在任何類型的組織冰凍介質(zhì)上包括 OCT,，但要避免切斷介質(zhì)。不要在 OCT 中包埋組織,，如果組織確實需要包埋,，用 TFM 替代 OCT。2）組織固定 到樣本盤后,，放置組織于干冰上 10 分鐘,，然后立即把固定有樣本的樣本盤安裝到冰凍切片機上,，等 5 分鐘之后進行切片,。3）切好的一些切片（不要 使用防卷板），如果組織溫度過低比如切片顯示出與刀片平行的裂縫,，先等 幾分鐘再進行下一個切片,，否則可繼續(xù)切。
l 浸泡的腦可用瓊脂糖或明膠包埋然后用冰凍切片機切片,。然而收集切片時（充滿切片槽）,，必須使用溶液 C。否則切片易干燥裂紋,。
l 如果用滑動切片機切浸泡的組織,，樣本盤和刀片都需維持在較低的溫度（0℃ 以下）按照操作手冊的描述切片固定在含有溶液 C 的載玻片上是重要的。
VI. 染色步驟
在染色過程中和蓋蓋玻片之前的任何一步都不要讓切片變干
1. 用雙蒸水或 Milli-Q 水沖洗切片兩次,，每次 4 分鐘,。
2. 把切片置于由 1 份溶液 D，1 份溶液 E 和 2 份的雙蒸水或 Milli-Q 水組成的混合液 中 10 分鐘,。
比如：
溶液 D 10ml
溶液 E 10ml
雙蒸水 20ml
注意
l 工作液zui好現(xiàn)配現(xiàn)用,，每 100ml 工作液zui多用于 100 張切片（比如小鼠腦）， 根據(jù)切片的大小,。
l 盛有工作液的瓶子或染色罐必須蓋好蓋子防止試劑蒸發(fā),。
l 為取得zui佳結(jié)果，孵育期間應(yīng)頻繁攪拌工作液,。
3. 用蒸餾水或 Milli-Q 水沖洗切片兩次,，每次 4 分鐘（蒸餾水應(yīng)頻繁更換新的）,。
4. 用結(jié)晶紫或硫堇對切片進行復(fù)染（可選步驟）。
注意
l 對于復(fù)染,，延長步驟 3 的時間,，比如用沖洗 4 次每次 5 分鐘代替原來的沖洗2 次每次 4 分鐘，或者更長的時間,。
5. 在 50%,，75%和 95%的乙醇中對切片進行脫水，每個濃度梯度脫水 4 分鐘（不要 跳過任何一個步驟）,。
6. 然后在無水乙醇中對切片進行脫水,，4 次，每次 4 分鐘（不要延長時間）,。
7. 在二甲苯中透明,，3 次，每次 4 分鐘,，并且用樹脂封片劑對蓋玻片進行封片,。
注意
l 蓋玻片之前切片可以暫時存于二甲苯中幾個小時。
l 為取得zui佳結(jié)果,，zui好用未稀釋的封片劑,。
l 用 Golgi 染色的切片無論何時都應(yīng)避光保存。
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